發酵工藝：工程菌高密度發酵工藝開發策略8項（以大腸杆菌為例）

利用重組DNA技術獲取的生物藥物在人類文明史上具有劃時代的意義。許多價值高産量低的功能蛋白如幹擾素、白細胞介素、集落刺激因子、生長激素、胰島素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中獲得了高效率表達。由于工程菌高密度培養能夠提高單位體積的産量，在工業生産上可以提高效率降低成本。所以，高密度培養一直都是發酵工程師們所追捧的熱點。本文就工程大腸杆菌高密度發酵工藝開發中涉及的關鍵控制點加以探讨。

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工程菌種

穩定可靠的菌種是工業化大生産的有力保障，直接關系到生産效率和成本高低。不同于傳統誘變育種模式，在對待工程菌菌種問題上，有人認為基因工程菌種構建完成後無需經過嚴格單克隆篩選，既節約時間成本又大大減少了工作量，這其實是一個認識誤區。這樣做出來的菌種很難連續穩定傳代50次以上，給中試放大以及後續的長期穩定生産留下了隐患。業内一般以能否穩定遺傳50代作為判斷工程菌種優劣的一個标準。

發酵所需的接種量不是越大越好，要适當。接種量過小導緻适應期過長，菌種易提前老化，也增加了雜菌污染的風險。接種量過大會過早引起溶氧不足，導緻發酵失控。且營養物質消耗過快也會影響後期正常生長。一般大腸杆菌接種量遵循逐級增大的原則，并将最後一級的放大倍數控制在10倍左右。

種子培養一定要在最佳條件下進行，培養時間不宜過長，當種子生長至最佳狀态時果斷移種。如果種子做的不好，其負面影響往往在發酵中後期會有所體現。工程菌種培養會加入抗生素，不僅是為了抑制雜菌生長，更重要的是為了給菌種形成正向的抗性篩選壓力，及時淘汰質粒丢失的菌株或者衰老的菌體，保證質粒攜帶菌群的正常生長與表達。

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高密度發酵培養基

除了必須的碳源以外，有機複合氮源在蛋白表達階段不可或缺。有機複合氮源可提供豐富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、維生素、生物素以及一些生物活性物質，能減輕細胞代謝負擔，促進外源蛋白表達。如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加時，存在一種非常有趣的代謝機制：當流加培養基中隻有酵母膏時，重組蛋白不穩定；而當流加培養基中隻有蛋白胨時，大腸杆菌難以再利用其所産生的乙酸。若将酵母膏和蛋白胨同時加入流加培養基中，不但所生産的重組蛋白非常穩定，細胞還能再利用代謝合成的乙酸。

無機氮源的選擇：(NH4)2HPO4為無機氮源時，(NH4)2HPO4自身含有的元素P可促進菌體生長。以(NH4)2SO4作為無機氮源時，S元素也可促進菌體生長。而硝酸鹽中的N原子不能被菌體直接利用，需要将其N原子還原成NH4 才能利用，在這一過程需要消耗一定的能量，因此菌體的生長受到了一定的限制，所以使用NaNO3或NH4NO3作為無機氮源時獲得的菌體量相對較少，不易實現高密度培養。

高密度發酵中，微量元素的作用也是不容忽視的，某種微量元素的缺失可能造成菌體量的大幅減少甚至生長受阻。此外，如果所用的菌種在構建時進行了必要的基因敲除，有些物質（一般是維生素或氨基酸）無法自身合成，如生物素、硫胺素等就必須輔助性添加。

無機鹽組分不僅用于維持細胞滲透壓或發酵環境pH穩定，其本身往往也參與到細胞代謝之中，如鎂離子是許多酶活性的中心，用法用量需要反複優化。

此外，泡敵是對菌體生長明确有毒害作用的成分，在不影響消泡效果的前提下，有必要摸索其用量的下限作為使用濃度，以減少對菌體的損傷，尤其在種子培養階段。

往期高密度發酵工藝技術鍊接分享：

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級聯控制溶氧

溶氧（DO）是需氧微生物生長所必需，在發酵過程中受很多方面因素的影響。28℃時氧在發酵液中的飽和濃度隻有7mg/L，比糖的溶解度小7000倍。高密度發酵中，菌體代謝強度大，溶氧需求量極高，對設備供氧能力要求也相應較高，DO往往成為生長代謝限制因素。為避免DO失控，DO設定值通常會處于較低的水平。由于DO電極校準時存在偏差或者電極老化檢測數據本身就不準确，很可能導緻罐内缺氧時未被發及時發現。判斷發酵過程是否受氧的限制，最簡單的辦法是把培養溫度降低2~4度（不影響發酵前提下），根據溶氧濃度變化趨勢來了解氧的供需情況。如果降溫後DO迅速回升，說明目前供氧狀況良好；如果降溫後DO值并無回升響應，此時DO檢測值很可能屬于“假陽性”，說明罐内處于一定程度的缺氧狀态。

培養液中的溶氧濃度的變化反映了菌體的生理狀況。通常在對數生長期DO明顯下降，從其下降的速率可估計菌的大緻生長情況。DO低谷到來的遲早與低谷時的DO水平随工藝和設備條件而異。二次生長時DO往往會從低谷處上升，到一定高度後又開始下降，這是利用第二種基質的表現。值得注意的是，在培養過程中并不是維持DO越高越好。即使是專性好氣菌，過高的DO對生長也可能不利。氧的有害作用是通過形成單線态氧、超氧化物基O2-、過氧化物基O22-或羟基自由基OH-，可破壞許多細胞組分。過氧化物基O22-或羟基自由基OH-，可破壞許多細胞組分。

溶氧控制方法：

在遵循先罐壓後攪拌再流量的調控順序原則上，改善溶氧的手段有以下幾種：

①在通氣中摻入純氧或富氧，使氧分壓提高；

②提高罐壓，能有效增加溶氧，但同時也會增加溶解CO2的濃度，因為它在水中的溶解度比氧高30倍。這會影響pH和菌的生理代謝，所以提高罐壓要控制在合理的範圍内，大腸杆菌發酵一般控制0.03~0.08MPa以内。

③改變通氣量，其作用是增加液體中夾持氣體體積的平均成分；在罐壓較大的情況下增加空氣流量，DO提高的效果顯著。但在罐壓較小的情況下提高空氣流量，對氧溶解度的提高不明顯，反而會使泡沫大量增加，導緻逃液。大腸杆菌發酵常用通氣量為0.5~1.5VVM。

④提高設備的供氧能力，從改善攪拌考慮更容易收效。改變攪拌器直徑或攪拌槳葉角度可增加功率輸出。另外調整擋闆的數目和位置，也可使剪切效果發生變化。比如四斜葉（萊甯A315攪拌槳）比其他槳葉能更有效地應用于高密度發酵中，并能顯著地減少功耗，在相同扭矩和功率下，四斜葉的傳質效率比Rushton槳葉高出30%。不同攪拌設計的溶氧分布效果差别非常大，見下圖：

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溫控代謝

大腸杆菌發酵最适溫度是37 ℃，當溫度最适菌體生長時，比生長速率将會增大。随溫度上升細菌代謝加快，其産生代謝副産物也會增加。這些副産物會對菌體的生長産生一定的抑制作用。菌體生長過快也會影響質粒的穩定性。降低培養溫度，菌體對營養物質的攝取和生長速率都會下降。同時也減少了有毒代謝副産物的産生和代謝熱的産生。有時降低溫度更有利于目的蛋白的正确折疊及表達。在重組大腸杆菌的發酵中不同發酵階段其最适溫度也不同，為了能獲得大量的目的蛋白，首先要保證菌體的量，因此在前期可優先考慮菌體的生長，到誘導階段應将目的産物的表達放在首位。大腸杆菌的不同克隆，誘導表達的溫度差異比較大，常用的有20度~32度，更高的誘導溫度意味着包涵體生成的概率成倍增加。

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pH作用機理

發酵過程中培養液的pH值變化是微生物在一定環境條件下代謝活動的綜合指标，是發酵過程中重要參數，對微生物的生長和産物的積累有很大的影響。培養基中的碳/氮比不合适，碳源過多，特别是葡萄糖過量或者中間補糖過多或溶解氧不足，緻使糖等物質的氧化不完全，培養液中有機酸大量積累，會導緻pH下降；培養基中碳源缺乏，或培養基中的碳/氮比不當，氮源過多會使pH值上升。

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誘導策略之分段工藝設計

對于帶有誘導型啟動子的重組微生物，選取合理的誘導時機非常重要，一般的誘導時間選在指數生長後期，而且誘導時的比生長速率最好能控制在0.2之内。選在此時誘導，可将菌體的快速生長期與蛋白合成期分開，使這兩個階段互不影響，有利于蛋白的高表達。而且此時已經得到了一定量的菌體，從發酵動力學角度，以及能耗、物料成本方面，都比較合理。相較于誘導時機，誘導劑濃度并不那麼重要，如果誘導時菌濃OD值在50以内，那麼用0.1mM的IPTG進行誘導就足夠了。

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代謝途徑之乙酸生成（大腸杆菌）

大腸杆菌有氧代謝産乙酸有兩條途徑，分别為丙酮酸氧化酶路徑（poxB）和乙酸激酶/磷酸乙酰轉移酶路徑（ackA-pta）。發酵液中乙酸以HAc和Ac－形式共存，HAc能滲透過細胞膜，在細胞内（pH約為7.5）再分解為H＋和Ac－。由于不斷滲透使胞外HAc和Ac－之間平衡向HAc移動，結果引起一個淨電中性H＋内流，降低了胞内pH。細胞自身的穩态機制需要能量以改變胞内pH降低趨勢，從而破壞了跨膜質子梯度，而跨膜質子梯度是氧化磷酸化和其它跨膜運輸所必需。也有報道認為乙酸等短鍊脂肪酸對DNA、RNA、蛋白質、脂質和肽聚糖等的合成均有抑制，而這些大分子物質是菌體生長和外源蛋白表達所必需的。通過HPLC在210nm下或者酶聯反應在450nm下比色可以精确測定乙酸濃度。一般認為在好氣性條件下，5～10g/L的乙酸濃度就能對比生長速率、菌體濃度以及後期蛋白收率等産生可觀測到的抑制作用。當培養液中乙酸濃度大于12g/L時外源蛋白的表達完全被抑制，當乙酸濃度大于15g/L時，細胞将會停止生長。

發酵調控減少乙酸濃度的措施：

01

改變培養基組分

培養基成分對乙酸的産生影響較大，尤其是碳源的選擇。研究表明目前最常用碳源的葡萄糖作為碳源時，極易導緻乙酸生成，而用甘油取代葡萄糖則可以避免乙酸積累。利用複合碳源葡萄糖 果糖、葡萄糖 麥芽糖取代單一碳源葡萄糖可改善大腸杆菌細胞代謝碳源流向，更有利于目的産物的表達。

流加補料過程中的碳氮比也很重要。若氮源過高，會使菌體生長過于旺盛，pH偏高，不利于代謝産物的積累，氮源不足，則菌體繁殖量少從而影響産量；碳源過多，則容易形成較多的乙酸，抑制菌體生長，碳源不足，則容易引起菌體的衰老和自溶。碳氮比不當還會引起菌體按比例的吸收營養物質，從而直接影響菌體的生長和産物的合成。此外，根據經驗，對于一個穩定的發酵工藝，如果總是在固定的發酵時間段出現溶菌現象，而且能排除噬菌體和染菌的可能性，那就可能是因為碳氮比不合理造成的。

02

降低比生長速率

比生長速率越高，乙酸産生越多，當比生長速率超過某個值時，乙酸開始産生。可以通過降低溫度，調節酸堿度，控制補料等方法來降低比生長速率。DO-stat，pH-stat,指數流加，複合式流加等發酵技術的應用對于解決發酵中的乙酸積累問題起了較大作用。需要注意的是，溶氧反饋和pH反饋調節補料的同時，必須要保證充足的溶氧，并嚴格控制pH值，而且補酸堿的速率盡量緩和，不能太快。

較低的比生長速率雖然産酸少，但同時會延緩細胞的生長導緻發酵周期延長,往往最适于細胞生長的比生長速率卻并不适于産物的形成。因此選取合适的比生長速率對于高密度、高表達發酵有重要意義。大腸杆菌比生長速率：μ=（In N2 - InN1) / (t2-t1)，其中，N1表示時間t1時的單位體積生物量，N2表示時間t2時的單位體積生物量。

03

限制性流加葡萄糖

大腸杆菌發酵大多采用補料分批培養，該模式能有效的優化微生物培養過程中的化學環境，使微生物處于最佳的生長環境。這種方式一方面可以避免某些營養成分初始濃度過高出現底物抑制現象，另一方面能夠防止限制性營養成分被耗盡而影響細胞的生長和産物的形成。

葡萄糖為碳源進行補料分批培養重組大腸杆菌時，采用限制性流加的方法控制其濃度在較低的範圍内以減少乙酸的生成，是目前高密度發酵常用的技術。一個好的流加控制系統必須避免兩種傾向：一是流加過量，補料組分在反應器中積累從而對細胞生長和産物形成産生抑制；二是流加不足，這可能會導緻細胞必需營養物的缺乏。比如恒溶氧反饋法：菌體代謝時會消耗氧，使溶氧下降，當葡萄糖濃度低到一定程度時菌體代謝下降，消耗氧能力下降，溶氧上升。因此，根據溶氧曲線補加葡萄糖，保持溶氧恒定，可以控制葡萄糖在一定的水平。

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噬菌體問題（細菌類工程菌）

染菌一直是困擾整個發酵工業的難題。而在工程菌發酵中，相比于染菌問題，噬菌體污染更為常見。污染工程菌發酵的噬菌體包括烈性噬菌體和溫和噬菌體兩種。烈性噬菌體浸染菌體後能夠在宿主菌體内快速複制增殖，産生許多子代噬菌體，并最終裂解細菌，極短時間内就可使發酵液澄清化（菌體剛開始裂解會釋放核酸物質使發酵液變得粘稠，随後逐漸澄清）；溫和噬菌體感染宿主菌後并不馬上開始增殖。而是将其基因整合于細菌染色體上，随細菌染色體的複制而複制，并随細菌分裂而分配至子代細菌的染色體中，形成前噬菌體，這個過程稱為溫和噬菌體的溶原性生長周期。在某些理化或生物因素的誘導下，整合的前噬菌體脫離宿主菌染色體，産生新的子代噬菌體，并使宿主菌裂解，這個過程叫溶菌性生長周期。

8.1

大腸杆菌浸染毒性噬菌體的鑒定

1.配制培養基：

LB液體培養基（1000ml水,10g蛋白胨：5g酵母粉：5g氯化鈉）、1.5%的固體培養基、0.7%的半固體培養基；

2.倒平闆：将1.5%的固體培養基溶化，每個平闆倒10-15ml的1.5%固體培養基，然後靜置至平闆上沒有水珠為宜；

3.分裝0.7%的半固體培養基：将0.7%的半固體培養基加熱溶化，然後用5ml的移液槍向每個試管加入5ml的半固體培養基；試管的數量和上一步平闆數是相同的；

4.等到試管中培養基溫度降至40℃左右時（不燙手），迅速向試管中加入100ul敏感菌和100ul的待測噬菌體液，搖勻；

5.将搖勻好的該培養基迅速倒入之前已倒有1.5%固體培養基平闆中，晃動平闆，使其鋪滿平闆，靜置；

6.待所有平闆倒好後，将其放入30℃恒溫箱中培養12h左右，即可觀察有無噬菌斑。

8.2

減少或避免噬菌體浸染的防範措施

1. 從菌種構建開始，克隆菌種的感受态細胞及其它試劑要保證純淨沒有被污染；

2. 發酵系統中的空氣系統要定期消毒并檢查；

3.發酵種子活化的環境要保持潔淨，并定期消毒；

4.發酵罐接種時要無菌操作，發酵過程取樣後的廢液要進行收集滅菌處理；

5.發酵過程的尾氣要通入吸收液處理後再排掉；

6.定期檢修發酵罐避免消毒死角的存在，發酵系統中的補料設施也要進行檢查；

7.發酵場所的地溝，排水池等要保持清潔，保證無活菌排放，并定期消毒；

8.3

浸染噬菌體後的處理措施

工程菌發酵浸染噬菌體還是以預防為主，一旦爆發後可通過以下措施進行處理：首先，通過雙層平闆去排查是否是浸染了毒性噬菌體。若是溫和噬菌體則難以發現，會讓發酵過程間斷性的發生異常，此時可通過PCR等方法确認是否浸染了溫和噬菌體。其次，确定浸染噬菌體後，就要從菌種、培養基、發酵系統管路、地溝、污水池、菌種室等進行全面的消毒，通常需要物理和化學方式相結合。如下措施供參考：

1.暫停發酵生産工作，用紫外燈照射加甲醛熏蒸的方式對整個發酵場所進行消毒一個月；

2.對現有菌種庫做嚴格的噬菌體檢測，一旦發現污染痕迹，馬上和其它菌種隔離并進行滅活處理；

3.用甲醛、臭氧或二氧化氯熏蒸發酵小試間、菌種室等位置；

4.用化學消毒劑（譬如75%酒精、新潔爾滅、二氧化氯稀溶液等）清潔試驗台、實驗室牆面和設備等表面；

5.一旦爆發噬菌體污染，停止任何形式的活菌排放，杜絕或盡量減少活菌開放性操作；

6.多點取樣進行噬菌體培養驗證，以檢驗滅活效果，直至無噬菌斑出現方可複産。