【心得】淺談逆向工程在仿制藥開發中的應用
各位醫藥界的大神們好，我是一個第三方公司裡一個小小的分析工程師，主要從事未知物分析，近半年的時間接觸到原研藥逆向工程，這裡和大家交流一下工作情況，主要還是需要向大家學習。以下就根據自己這半年的學習總結了一些些，對于逆向工程本人還是沒有那麼專業，如有不對的地方期望大家批評指正。
淺談逆向工程的主要研究内容、研究思路和關鍵技術
通過具體案例分享逆向工程的應用
正文
什麼是逆向工程？這裡所講的逆向工程主要是原研藥也就是參比制劑逆向工程，是一種藥品制備再現的過程，也就是對目标原研藥進行逆向分析，從而得出定性配方、原料藥的晶型、輔料的含量及制備工藝等要素，以制備出質量和療效與原研藥一緻的産品。
逆向工程的應用有助于降低制劑開發的難度、減少處方開發的工作量、縮短研發的時間，進而提高BE的通過率。逆向工程研究并非100%和原研一緻，這也是不可能做到的，而是要做到關鍵指标和原研一緻。得出關鍵性指标數據，幫助藥企縮短研發時間，搶占市場先機。
我司是在16年的時候大力發展醫藥事業。那個時候接觸到一緻性評價，發現很多藥企需要對原研藥進行剖析，以縮短制劑研發時間，搶占市場。因此，我司開始着手準備這塊業務，對接并服務藥企。
那麼如何進行仿制藥逆向研究呢？
一、調研
工欲善其事必先利其器。歐美的藥監局數據庫均對中國開放，找到原研制劑的相關資料并不難。另外，很多藥企客戶是可以提供相關資料的。主要是重點關注原研藥的處方成分、單位重量、外觀、原料藥晶型、包衣材料、包裝材料、以及其臨床和藥代動力學參數。可以通過查詢相關的專利、專業的數據庫、藥監局官網和百科等調研以上相關參數資料。
我司的重點是對原研藥進行剖析，包括原研藥中API和輔料的成分，尤其是輔料成分，需要針對性的查找相關輔料的性質、性能及定性定量的方法。
二、剖析
逆向工程主要的研究内容是原料藥、輔料和工藝。首先原料藥的晶型、粒度及雜質等都會影響其效用，因此需要前期确認原料藥的這些關鍵性參數。我司針對這一塊有分子結構确證和雜質方法開發等服務。
其次就是輔料，輔料是制劑中補課缺少的部分，具有賦型、崩解、穩定等作用。輔料的含量、型号等都需要進行确認才能夠保證與原研藥的一緻性。解碼一個參比制劑的定量成分，首先應該确定哪種輔料最影響處方的性能質量（即穩定性或溶解性）。這些數據将提供有關逆向工程所需要的資源信息。對輔料的定量是一項挑戰，因為其他輔料可能會幹擾。因此輔料必須首先從使用技術，如溶解性，實現片劑基質分離，常用的方法有高效液相色譜法、高效薄層層析法和分子排阻色譜法等。再一個就是制備工藝，工藝的不同也會對藥效産生影響，所以需要盡可能的還原制備工藝，尤其是制粒的方式。
1、原料藥的晶型
首先需要通過查詢相關專利确認原研制劑中原料藥的晶型及粒徑等信息，其次就是通過X射線粉末衍射、紅外光譜法、熱分析及拉曼光譜法等分析手段，确認原料藥的晶型。目前片劑中晶型檢測常用X射線粉末衍射。除乳糖外，其他輔料無明顯的晶型衍射。通過對比原料藥、原研制劑和自制劑在相同條件下的XRD測試圖，确定原料藥的晶型結構。如果判斷兩個晶态樣品的晶型物質狀态是否一緻時，應該滿足衍射峰的數量相同、衍射峰位置誤差範圍在±0.2°内。如果滿足以上條件，可以認為晶型一緻。這個方法主要是針對擁有晶型的原料藥且原料藥占比比較高的制劑。
2、輔料的含量
可以查閱相關文獻等資料，确定輔料組成及大緻含量。片劑中常用的輔料微晶纖維素、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮等。對輔料含量進行測定在仿制藥研發中尤為重要。常用的輔料含量剖析方法有元素分析法、色譜光譜法、洗滌分離法等。其中元素分析法主要測試手段有ICP-OES和ICP-MS等，針對硬脂酸鎂、二氧化矽等還有特征元素的輔料的測定。色譜、光譜法包括HPLC、GC-MS、LC-MS和UV等手段，乳糖的含量可以通過HPLC-ELSD法進行測定。硬脂酸可以通過GC-MS進行測定。十二烷基硫酸鈉可以通過LC-MS進行測定。洗滌分離法主要是針對樣品中不溶輔料，如澱粉、微晶纖維素等。片劑中常用的輔料除微晶纖維素和硬脂酸鎂不溶外，其他幾乎全溶，因此可以通過對片劑進行溶劑洗滌分析，稱取不容物的含量，得出微晶纖維素的含量。
3、工藝
由于我司沒有制藥經驗，這一塊研究的比較少。關于工藝方面，目前隻是通過掃描電鏡方法觀察制劑的微觀形貌，試圖從中找出相關規律。這裡比較好确認的是微丸造粒，在掃描電鏡下可以很清楚的看到微丸顆粒。
三、案例分析
1、液體制劑
以鹽酸莫西沙星滴眼液為例，原研說明書上公布其輔料有硼酸、氯化鈉和注射用水，可能還有鹽酸或者氫氧化鈉調節pH用。結合原研說明書上的信息，對制劑進行相關的測試分析，由此就可以确認處方，避免了處方篩選的過程。具體如下：
成分 |
定性 |
定量 |
鹽酸莫西沙星 |
FTIR、MS、NMR |
NMR、HPLC |
硼酸 |
組分表、ICP-OES |
ICP-OES |
氯化鈉 |
XRF、、ICP-OES、IC |
ICP-OES、IC |
水 |
水分測試 |
水分測試 |
通過對液體制劑進行烘幹處理，進行FTIR、MS和NMR測試，可以确定制劑中添加的是鹽酸莫西沙星，為原料藥。另外，可以通過核磁内标法和高效液相色譜法對原料藥進行定量分析，由于核磁内标法收到積分面積的影響很大，因此定量上存在一定誤差。這裡更推薦使用高效液相色譜法對原料藥進行定量分析，可以進行方法學驗證，保證方法和結果的穩定和準确性。通過原研說明說我們知道樣品中含有硼酸，這裡可以通過ICP-OES對硼元素進行定量分析，由硼元素的含量計算出硼酸的含量。氯化鈉可能為鹽酸和氫氧化鈉反應産物，可以通過ICP-OES對鈉元素進行測定，通過IC對氯離子進行測定，另外結合樣品本身的pH值計算出氯化鈉的含量。樣品中的水分可以通過卡爾費休法進行水分含量測定。
2、片劑輔料
以HJ08原研制劑為例，客戶主要關注制劑中的乳糖、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸鎂和交聯羧甲基纖維素鈉的含量。針對客戶提出的物質，通過查詢相關的文獻資料，确認各物質定量的方法，具體如下：
成分 |
定量 |
乳糖 |
HPLC-ELSD |
十二烷基硫酸鈉 |
LC-MS |
硬脂酸鎂 |
ICP-OES（幹法消解） |
交聯羧甲基纖維素鈉 |
ICP-OES和差減 |
客戶已經告知原研藥中輔料信息，需要對輔料含量進行精确測試。通過查詢相關資料，輔料中乳糖的含量可以通過HPLC-ELSD進行準确定量分析。十二烷基硫酸鈉為陰離子表面活性劑，且溶于水，因此可以通過LC-MS對十二烷基硫酸鈉進行含量測定。硬脂酸鎂可以通過ICP-OES進行鎂元素含量測定，從而計算硬脂酸鎂的含量。這裡需要注意的是，硬脂酸鎂不溶于水、不溶于酸堿等溶液，因此在進行濕法酸消解時，有可能會消解不完全，導緻結果存在偏差。在不斷的嘗試後，發現可以進行幹法消解，也就是先對制劑進行燒灰分處理，然後在測試鎂元素含量，這個前處理方法大大提高了硬脂酸鎂含量測定的準确度。交聯羧甲基纖維素鈉可以通過将其他輔料全部準确定量後進行差減而得出含量。另外，交聯羧甲基纖維素鈉一個重要指标就是取代度。如果查詢到其取代度，并查詢基本結構單元，可以通過鈉元素的含量計算出交聯羧甲基纖維素鈉的含量。由于交聯羧甲基纖維鈉較為複雜，其含量測定方法還在研究。
3、輔料牌号确認
以聚維酮為例，不同型号的聚維酮分子量不同，因此可以通過測試聚維酮的分子量分布，确認聚維酮的具體型号，具體如下：
水相GPC測試 |
Mn |
Mw |
Mz |
Poly dispersity |
聚維酮K17 |
5467 |
6836 |
8454 |
1.25 |
聚維酮K12 |
4367 |
5135 |
6178 |
1.18 |
樣品 |
5586 |
6729 |
8084 |
1.20 |
從上表可以看出，樣品中的聚維酮的分子量和聚維酮K17接近，因此基本可以判定樣品中使用的是聚維酮K17。
另外，我司還做過一些定性研究，比如澱粉、植物油和纖維素等牌号的确定研究。以羟丙基甲基纖維素為例，對不同牌号的羟丙甲基纖維素進行衍生化，在進行GC-MS測試，通過對測試數據的計算，可求的實測到羟丙甲基纖維素中甲氧基和羟丙基的含量，通過數據的換算可對羟丙基甲基纖維素的牌号進行判斷。但是如果體系中有澱粉或者其他纖維素會影響牌号的确認。
在由藥研和蒲公英共同主辦，即将于11月17-19日在北京召開的上，原美國強生主任科學家、諾華制藥資深院士、現北京羅諾強施聯合創始人、總經理魏世峰博士将作題為：《反向工程及高技術壁壘仿制藥産品開發》的報告，相信将給我們帶更多來有關反向工程相關的精彩的内容！
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