三羧酸循環的最後一步是蘋果酸氧化成草酰乙酸,由L-蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase,MDH)催化。這是第四次氧化,生成NADH。這個反應在能量上不利,由于草酰乙酸的不斷消耗,而得以持續進行。
蘋果酸的氧化
MDH以二聚體發揮作用,被檸檬酸變構抑制,可被ATP、ADP、延胡索酸、天冬氨酸和高濃度草酰乙酸抑制。
MDH也有不同的細胞定位。線粒體MDH2參與三羧酸循環,細胞質MDH1參與NADH的轉運(蘋果酸穿梭)過程,聯系着糖酵解與氧化磷酸化。有研究認為腫瘤的代謝調控與MDH密切相關(Oncogene. 2017)。
蘋果酸脫氫酶參與腫瘤代謝模型,引自Biomol Ther (Seoul). 2018
有很多關于MDH結構與功能的研究,特别是關于其催化機制、底物特異性和熱穩定性方面。據報道,來自超嗜熱古細菌Pyrobaculum calidifontis的蘋果酸脫氫酶Pcal_1699最适溫度為90°C,在沸水中加熱6小時後仍保留90%以上的活性(Extremophiles. 2016)。
總體來說,每輪循環産生3個NADH,1個FADH2,1個GTP,相當于10個ATP。加上酵解和丙酮酸脫氫,每個葡萄糖有氧氧化共産生30-32個ATP。注意丙酮酸脫氫酶産生的NADH已經在線粒體中,不需要穿梭。
三羧酸循環的一個難點是其不對稱反應,或者說是碳原子去向問題。三羧酸循環整體上每輪氧化掉一個乙酰輔酶A,放出兩個二氧化碳。但具體到每一輪反應,放出的二氧化碳來自草酰乙酸的1、4位,新加入的乙酰輔酶A并不會生成二氧化碳。乙酰輔酶A的1位碳原子進入新生成的草酰乙酸1位或4位,下一輪放出;其2位碳則進入新生草酰乙酸的2位或3位。每一輪中,草酰乙酸的3位進入新生草酰乙酸的1、4位,下一輪放出;2位則進入2、3位,即有一半幾率在兩輪後放出。
三羧酸循環中碳原子的去向
三羧酸循環的作用不僅是氧化乙酰輔酶A,它還溝通糖、脂和蛋白質代謝。氨基酸和許多小分子物質通過三羧酸循環互相轉化。所以三羧酸循環的中間物可以作為生物合成的前體,如草酰乙酸和α-酮戊二酸可用于合成天冬氨酸和谷氨酸,琥珀酰輔酶A可用于合成卟啉等。
如果三羧酸循環的中間物被“挪用”過多,就會降低草酰乙酸濃度,抑制三羧酸循環,影響機體能量供應。這時就需要用其它物質補充草酰乙酸,稱為“回補反應”。
線粒體中的丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)可以催化丙酮酸與ATP、水和CO2生成草酰乙酸。反應需要鎂離子和生物素。丙酮酸羧化酶是調節酶,平時活性較低,當草酰乙酸不足時,乙酰輔酶A濃度升高,可以促進其活性。
丙酮酸的羧化反應
磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)也可用于回補反應,同時生成一個GTP。反應由磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PCK)催化,有胞漿型的PCK1和線粒體型的PCK2。這是一個可逆反應,在糖異生時催化草酰乙酸生成PEP。
在氨基酸較多時,可以由天冬氨酸轉氨生成草酰乙酸,或者由谷氨酸生成α-酮戊二酸,由異亮氨酸、缬氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸生成琥珀酰輔酶A,再通過三羧酸循環轉化為草酰乙酸。
參考文獻:
E A Hanse, et al. Cytosolic malate dehydrogenase activity helps support glycolysis in actively proliferating cells and cancer. Oncogene. 2017 Jul 6;36(27):3915-3924.
Soo-Youl Kim. Cancer Energy Metabolism: Shutting Power off Cancer Factory. Biomol Ther (Seoul). 2018 Jan 1;26(1):39-44.
Ghazaleh Gharib, et al. Pcal_1699, an extremely thermostable malate dehydrogenase from hyperthermophilic archaeon Pyrobaculum calidifontis. Extremophiles. 2016 Jan;20(1):57-67.
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