疾病診斷之甲基化qPCR檢測
通常意義上的DNA甲基化是指基因組DNA序列上CpG島的二核苷酸5’端胞嘧啶轉變為5’甲基胞嘧啶（5’methylcytosine, 縮寫5mC）。在哺乳動物細胞中，甲基化主要發生在CpG島，片段長度為500-1000bp，約56%的編碼基因含有此結構。CpG島和許多生命表征如X染色體失活、細胞發育以及疾病形成等有緊密的聯系，這也使得對于CpG島甲基化的探索成為表觀遺傳學研究的重點。特别是在疾病診斷過程中，CpG島甲基化程度的檢測，很大程度上的幫助患者預後。
圖1.CpG島胞嘧啶甲基化
我國對DNA甲基化檢測最近注重起來了。2021年8月25号，北京市醫療保障局發布京醫保發〔2021〕23号文件，文件中規範調整了北京市公立醫療機構共284項醫療服務價格項目，以進一步完善醫療服務價格政策。其中基因甲基化檢測被作為實驗室診斷項目納入甲類醫保服務項目及甲類工傷保險項目内，即全額納入報銷範圍。與此同時，在廣西和福建等地也開展了相關甲基化檢測項目。
圖2.北京市部分醫療服務價格項目規範調整信息
甲基化檢測市場預估雖然較為可觀，但是從目前的行狀态來看，甲基化檢測整體産業鍊并沒有很大的發展，這需要産業從業人員在國家政策的指導下向前推動。行業發展滞緩的部分原因：檢測服務機構和試劑廠商數量不足，無法滿足市場需要。NMPA批準甲基化檢測試劑廠商如鹍遠、透景、廈門艾德、廣州康立明等，不足10家公司；甲基化檢測種類較少，目前NMPA批準的甲基化檢測種類僅涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4，主要是熒光PCR檢測；醫療系統甲基化檢測項目沒有全國性鋪開等。
01 CpG島（CpG island） CpG島是基因組上一段CpG二核苷酸高度聚集的DNA回文序列。在哺乳動物細胞中，CpG島常常富集于轉錄調控區周圍，如啟動子和第一外顯子上。大小約為100-1000bp，且常常是處于非甲基化的狀态。
CpG島與甲基化。CpG島一般處于管家基因和活躍表達基因啟動子周圍，而在不活躍表達的基因附近CpG島常常處于甲基化。一旦CpG島的胞嘧啶發生甲基化，就會抑制轉錄因子的結合，進而抑制基因的表達。與此同時，甲基化的CpG島還會吸引一些蛋白複合物，緻使組蛋白乙酰化以改變染色質結構，促使轉錄沉默。另外，CpG島中甲基化胞嘧啶（C）可以通過脫酰胺作用轉化為胸苷（T），即發生CpG到TpG的轉變，這種轉變體内錯配修複酶無法修複，造成體細胞突變。
圖3.CpG島甲基化與基因表達的關系
02 CpG島甲基化檢測 CpG島甲基化與許多疾病有密切的聯系，因此對CpG島甲基化程度的檢測可以很好的患者預後。CpG島甲基化檢測分為三大類：一類是基因組甲基化水平分析，如高效液相色譜HPLC、高效毛細管電泳HPCE法；另外一類是候選基因甲基化分析，如重亞硫酸鹽測序法、甲基化熒光PCR法、甲基化特異性PCR（MS-PCR）、焦磷酸測序等。還有一類為基因組範圍的DNA甲基化模式(Methylation pattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析，如RLGS、MCA等。目前，NMPA批準的甲基化檢測試劑盒廠商均為熒光PCR法。熒光PCR法高效，迅速，具備可重複、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。
CpG島甲基化熒光PCR檢測法要結合重亞硫酸鹽處理，其原理為：首先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，将非甲基化CpG島轉換為甲基化的形式。然後設計的探針與待測位點結合，随着PCR的擴增進行，探針被切割釋放熒光基團發出熒光。通過測定每個擴增循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化程度。通過解讀報告，預判患者情況。
圖4.CpG島甲基化熒光PCR檢測法示意圖
近岸蛋白（Novoprotein）立足于表觀遺傳疾病診斷研究，開發出一款可以高效檢測CpG島甲基化的熒光PCR試劑盒，隻需要在試劑裡面添加引物探針即可快速檢測靶基因。
優秀的擴增性能，能夠高效擴增靶基因： 圖5. Novoprotein試劑對靶位點的擴增
較強的普适性，即可單重擴增，也可雙重擴增： 圖6.Novoprotein試劑雙重擴增靶位點無壓力
試劑穩定性強，37℃放置14天，擴增性能不變： 圖7.Novoprotein試劑放置14天後仍可擴增靶位點
試劑抗逆性強，反複凍融破壞20次，擴增性能不變： 圖8.Novoprotein試劑反複凍融20次擴增性能不變
03 CpG島與疾病 CpG島大部分存在于轉錄活化區域，如啟動子和第一外顯子周圍，與基因的表達有密切的關系。若體細胞CpG島甲基化狀态發生改變，那麼原有的基因的表達模式發變化，必定影響生命表征。如常見的癌變，正常體細胞抑癌基因啟動子區CpG 島甲基化程度較低，抑癌基因正常表達，抑制體細胞癌變。一旦CpG島高度甲基化，抑癌基因發生沉默，無法正常表達，體細胞極易癌變。再如智力遲鈍症狀，在胚胎發育過程中，因為某些特定基因在配子中逃避去甲基化，導緻這些基因高度甲基化，無法表達，影響胚胎發育。因此，基因組甲基化程度有着嚴格的标準，一旦出現甲基化異樣，那麼常常伴随非正常表征的出現。
目前來看，我國甲基化的檢測的項目比較少，僅涉及腸癌、肺癌、膠質瘤幾種疾病。
相關産品
近岸蛋白質是一家專業從事mRNA疫苗原料、靶點蛋白、細胞因子、分子試劑和診斷原料的研發生産及抗體藥CRO服務的高新技術企業。公司産品及服務涵蓋mRNA疫苗、抗體藥、細胞治療、IVD、NGS、基因編輯等多個領域；并提供差異化抗原開發-噬菌體建庫-高通量候選分子篩選-人源化與親和力成熟-快速重組表達與表征等一站式抗體藥物開發服務。 詳詢www.novoprotein.com.cn或緻電400-600-0940。 （轉化醫學網360zhyx.com）
圖1.CpG島胞嘧啶甲基化
我國對DNA甲基化檢測最近注重起來了。2021年8月25号，北京市醫療保障局發布京醫保發〔2021〕23号文件，文件中規範調整了北京市公立醫療機構共284項醫療服務價格項目，以進一步完善醫療服務價格政策。其中基因甲基化檢測被作為實驗室診斷項目納入甲類醫保服務項目及甲類工傷保險項目内，即全額納入報銷範圍。與此同時，在廣西和福建等地也開展了相關甲基化檢測項目。
圖2.北京市部分醫療服務價格項目規範調整信息
甲基化檢測市場預估雖然較為可觀，但是從目前的行狀态來看，甲基化檢測整體産業鍊并沒有很大的發展，這需要産業從業人員在國家政策的指導下向前推動。行業發展滞緩的部分原因：檢測服務機構和試劑廠商數量不足，無法滿足市場需要。NMPA批準甲基化檢測試劑廠商如鹍遠、透景、廈門艾德、廣州康立明等，不足10家公司；甲基化檢測種類較少，目前NMPA批準的甲基化檢測種類僅涉及septin9、SHOX2、RASSF1A、RNF180、SDC2、MGMT、BMP3、NDRG4，主要是熒光PCR檢測；醫療系統甲基化檢測項目沒有全國性鋪開等。
01 CpG島（CpG island） CpG島是基因組上一段CpG二核苷酸高度聚集的DNA回文序列。在哺乳動物細胞中，CpG島常常富集于轉錄調控區周圍，如啟動子和第一外顯子上。大小約為100-1000bp，且常常是處于非甲基化的狀态。
CpG島與甲基化。CpG島一般處于管家基因和活躍表達基因啟動子周圍，而在不活躍表達的基因附近CpG島常常處于甲基化。一旦CpG島的胞嘧啶發生甲基化，就會抑制轉錄因子的結合，進而抑制基因的表達。與此同時，甲基化的CpG島還會吸引一些蛋白複合物，緻使組蛋白乙酰化以改變染色質結構，促使轉錄沉默。另外，CpG島中甲基化胞嘧啶（C）可以通過脫酰胺作用轉化為胸苷（T），即發生CpG到TpG的轉變，這種轉變體内錯配修複酶無法修複，造成體細胞突變。
圖3.CpG島甲基化與基因表達的關系
02 CpG島甲基化檢測 CpG島甲基化與許多疾病有密切的聯系，因此對CpG島甲基化程度的檢測可以很好的患者預後。CpG島甲基化檢測分為三大類：一類是基因組甲基化水平分析，如高效液相色譜HPLC、高效毛細管電泳HPCE法；另外一類是候選基因甲基化分析，如重亞硫酸鹽測序法、甲基化熒光PCR法、甲基化特異性PCR（MS-PCR）、焦磷酸測序等。還有一類為基因組範圍的DNA甲基化模式(Methylation pattern)與甲基化譜(Methylation Profiling)分析，如RLGS、MCA等。目前，NMPA批準的甲基化檢測試劑盒廠商均為熒光PCR法。熒光PCR法高效，迅速，具備可重複、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。
CpG島甲基化熒光PCR檢測法要結合重亞硫酸鹽處理，其原理為：首先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段，将非甲基化CpG島轉換為甲基化的形式。然後設計的探針與待測位點結合，随着PCR的擴增進行，探針被切割釋放熒光基團發出熒光。通過測定每個擴增循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化程度。通過解讀報告，預判患者情況。
圖4.CpG島甲基化熒光PCR檢測法示意圖
近岸蛋白（Novoprotein）立足于表觀遺傳疾病診斷研究，開發出一款可以高效檢測CpG島甲基化的熒光PCR試劑盒，隻需要在試劑裡面添加引物探針即可快速檢測靶基因。
優秀的擴增性能，能夠高效擴增靶基因： 圖5. Novoprotein試劑對靶位點的擴增
較強的普适性，即可單重擴增，也可雙重擴增： 圖6.Novoprotein試劑雙重擴增靶位點無壓力
試劑穩定性強，37℃放置14天，擴增性能不變： 圖7.Novoprotein試劑放置14天後仍可擴增靶位點
試劑抗逆性強，反複凍融破壞20次，擴增性能不變： 圖8.Novoprotein試劑反複凍融20次擴增性能不變
03 CpG島與疾病 CpG島大部分存在于轉錄活化區域，如啟動子和第一外顯子周圍，與基因的表達有密切的關系。若體細胞CpG島甲基化狀态發生改變，那麼原有的基因的表達模式發變化，必定影響生命表征。如常見的癌變，正常體細胞抑癌基因啟動子區CpG 島甲基化程度較低，抑癌基因正常表達，抑制體細胞癌變。一旦CpG島高度甲基化，抑癌基因發生沉默，無法正常表達，體細胞極易癌變。再如智力遲鈍症狀，在胚胎發育過程中，因為某些特定基因在配子中逃避去甲基化，導緻這些基因高度甲基化，無法表達，影響胚胎發育。因此，基因組甲基化程度有着嚴格的标準，一旦出現甲基化異樣，那麼常常伴随非正常表征的出現。
目前來看，我國甲基化的檢測的項目比較少，僅涉及腸癌、肺癌、膠質瘤幾種疾病。
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