唐紅：一種有前途的新型HBV血清标志物——HBcrAg

▋ 陳恩強， 唐紅

四川大學華西醫院

随着對HBV血清标志物研究的不斷深入，乙型肝炎核心相關抗原（HBcrAg）逐漸進入臨床醫師的視線，其在慢性乙型肝炎（CHB）抗病毒療效評價和臨床轉歸預測中的價值也逐漸被大家所認可。目前研究發現，HBcrAg由HBV前C/C區編碼的HBcAg、HBeAg與P22cr（22 kD precore protein）3種蛋白質組成（共享C基因編碼的149個氨基酸序列），其中P22cr 是HBeAg 形成前的中間産物，包含從-28~150的氨基酸序列的一種前核心蛋白，包括未剪切的信号序列，但缺少C末端的精氨酸富集區域，常存在于空缺的、不含病毒核心的病毒顆粒中。

目前，臨床對于血清HBcrAg的檢測主要采用化學發光酶免疫分析法（CLEIA），且日本富士瑞必歐株式會社已經開發出可用于商業化檢測的試劑盒。血清HBcrAg 的計量單位為U/ml，以大腸埃希菌表達的重組前體 HBeAg（pro-HBeAg）為标準，與前體 HBeAg 10 fg/ml相對應的HBcrAg的免疫反應被定義為1 U/ml。相對于以轉錄為媒介的擴增方法，CLEIA法檢測血清HBcrAg具有更好的敏感性，且當把cut-off值設置為1.0×10^3 U/ml時，血清HBcrAg分析的特異性可以達到100%。事實上，CLEIA法檢測血清HBcrAg的最低檢測下限為4×10^2 U/ ml，相當于4 pg/ml的pro-HBeAg（一種包含HBeAg的-10~183 氨基酸的重組蛋白）免疫反應性。目前認為，即使CHB患者血清中存在抗-HBc和抗-HBe，或者由前C區突變引起血清轉換使HBeAg呈陰性時，也不會影響CLEIA法檢測HBcrAg的敏感性和準确性。

1 血清HBcrAg是反映肝内HBV cccDNA的較好替代指标

HBV造成的慢性感染可進展為肝硬化乃至肝細胞癌，對人類健康有巨大威脅。目前認為，HBV共價閉合環狀DNA（cccDNA）的長期存在是導緻CHB難以治愈和肝癌發生的關鍵因素，因此動态監測肝内cccDNA的水平變化對于了解患者病情變化和評估治療效果具有十分重要的意義。由于肝組織内HBV cccDNA的檢測需要做肝活組織檢查，而肝活組織檢查是一種有創檢查，多數患者不願意接受（特别是進行多次肝活組織檢查），故通過肝活組織檢查來監測患者肝組織中的HBV cccDNA水平在臨床上還存在着較大的困難，目前迫切需要尋找一種操作方便且能反映肝組織内cccDNA水平的血清學替代檢測指标。目前認為，患者外周血中HBcrAg、HBV RNA和HBsAg定量均可作為反映肝組織内cccDNA水平的血清學替代檢測指标。

四川大學華西醫院唐紅教授團隊曾分析139例接受肝活組織檢查CHB患者血清中HBcrAg、HBsAg、HBV DNA和肝内cccDNA的水平，發現血清HBcrAg水平與肝内HBV cccDNA水平呈顯著相關（r=0.929, P＜0.001），且這一相關性明顯優于HBsAg（r=0.742, P＜0.001）和HBV DNA（r=0.854, P＜0.001）。進一步對32例接受恩替卡韋治療的患者進行動态分析發現，肝内HBV cccDNA的減少與外周血HBsAg和HBcrAg下降相關，但相較于外周血HBsAg（r=0.572, P=0.001）、HBcrAg（r=0.665, P＜0.001）與HBV cccDNA下降幅度具有更好的相關性。據此認為，相較于血清HBsAg或HBV DNA水平，外周血HBcrAg水平與肝細胞内HBV cccDNA水平的正相關性更強。

唐紅教授團隊近期對CHB患者外周血HBcrAg、HBV RNA和HBsAg反映肝組織内HBV cccDNA水平的情況也進行了直接的比較。該項研究共納入110例接受了肝穿刺活組織檢查且未接受過任何抗病毒治療的CHB患者，其中包括85例HBeAg陽性患者和25例HBeAg陰性患者。研究發現，在HBeAg陽性患者中，外周血HBcrAg水平與HBsAg和HBV RNA水平均呈正相關，且HBV RNA水平與HBsAg水平亦呈正相關；而在HBeAg陰性患者中，外周血HBcrAg、 HBsAg和 HBV RNA三者間無顯著相關。多因素線性回歸分析提示，外周血HBcrAg、HBsAg和HBV RNA在HBeAg陽性患者中均與肝内cccDNA水平顯著相關；但在HBeAg陰性患者中，僅HBcrAg與肝内cccDNA水平顯著相關。在HBeAg陽性患者中，盡管HBcrAg水平受肝組織炎症活動度和外周HBV DNA水平高低影響，但通過分層分析發現，在不同肝組織炎症活動度和外周HBV DNA水平條件下，外周血HBcrAg水平和肝内cccDNA水平均可以保持較好的相關性。

根據目前可獲得文獻資料，上述研究是基于中國大陸CHB患者開展的首個直接比較外周血HBcrAg、HBsAg和HBV RNA定量（三個最備受關注的血清學指标）與肝組織内的HBV cccDNA相關性的研究，結果首次提示了外周血HBcrAg水平較HBsAg定量和HBV RNA能更好地反映肝組織内的HBV cccDNA水平，且不受HBeAg狀态影響。由此可見，在現有的條件下，通過檢測外周血HBcrAg水平，可較準确反映肝内HBV cccDNA水平，這對臨床客觀評估現有抗病毒藥物的療效以及将來選擇停藥時機具有重要意義。

2 血清HBcrAg可預測自發或治療引起的HBeAg血清學轉換

HBeAg血清學轉換是HBV感染獲得免疫控制的結果，一旦發生HBeAg血清學轉換，就預示着患者未來發生HCC的風險大大減少。在真實的臨床世界中，部分機體免疫力強的患者，即使不通過抗病毒治療也能自發的實現免疫控制，出現HBeAg血清學轉換。但大部分患者還是需要通過抗病毒治療才能實現HBeAg血清學轉換。

唐紅教授團隊近期對31例接受PEG-IFN治療的HBeAg陽性CHB患者進行為期6個月的随訪研究發現，9例患者在停止IFNα治療後的随訪過程中出現HBeAg血清學轉換。在發生HBeAg血清學轉換的患者中，血清HBcrAg水平在PEG-IFNα治療結束後的随訪過程中仍表現出持續顯著下降，而血清HBsAg水平則下降不明顯；且受試者工作特征曲線分析表明，PEG-IFNα治療第1個月時的血清HBcrAg絕對定量水平和相對于治療前的下降幅度均可較好預測PEG-IFNα治療停藥随訪6個月時的HBeAg血清學轉換。結果提示，PEG-IFNα治療早期的血清HBcrAg水平是預測PEG-IFNα治療停藥随訪6個月時的HBeAg血清學轉換。

我國吉林大學第一醫院牛俊奇教授團隊研究發現，血清HBcrAg可有效預測恩替卡韋或PEG-IFNα治療的HBeAg陽性CHB患者的HBeAg血清學轉換。

來自北京大學人民醫院魏來教授團隊的研究結果提示，檢測血清HBcrAg水平有助于對CHB的自然病程進行監測，且HBcrAg水平的動力學變化可以準确預測CHB患者的自發性HBeAg血清學轉換。

唐紅教授團隊研究發現，血清HBcrAg水平與HBV慢性感染的自然史分期有關。血清 HBcrAg 在免疫耐受期和免疫清除期處于最高水平，而在非活動攜帶期則處于最低水平，提示定量檢測血清HBcrAg水平或将幫助确定HBV感染所處的自然史階段。

Steo等于2014年報道的研究結果顯示，HBeAg陽性慢性肝炎與HBeAg陽性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别為7.92和8.54 log U/ml, 而HBeAg陰性慢性肝炎與HBeAg陰性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别為4.92和2.6 log U/ml。

Maasoumy等于2015年報道的研究結果亦顯示，HBeAg陽性慢性肝炎與HBeAg陽性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别為8.11和8.41 log U/ml, 而HBeAg陰性慢性肝炎與HBeAg陰性慢性感染者的血清HBcrAg中位水平分别為4.82和2.00 log U/ml。

由此可見，血清HBcrAg不僅可顯著區分HBeAg陽性和HBeAg陰性的慢性肝炎/慢性感染者，而且有助于區分HBeAg陰性慢性肝炎與HBeAg陰性慢性感染者。然而，目前關于HBV慢性感染自然史各分期的血清HBcrAg最佳截止值仍有待确定，未來期待有更多大樣本、更長周期的前瞻性研究進一步探索。

3 血清HBcrAg可預測停藥複發

HBsAg消失或血清學轉換是目前CHB抗病毒治療安全停藥的公認标準，但達到此目标并不容易。所以在實際的臨床診療過程中，對于部分HBsAg陽性的CHB患者，可能會因為各種原因而需要考慮停藥。如何讓患者停藥後能夠始終處于非活動性攜帶者狀态是臨床醫師需要認真思考的問題。目前認為，決定CHB抗病毒停藥後能否始終處于非活動性攜帶狀态主要取決于兩個關鍵因素，即殘存于肝細胞中的HBV cccDNA複制能力和機體對HBV特異性免疫清除能力。

殘存于肝細胞中的HBV cccDNA的複制能力受限于其水平、啟動因素和複制環境等。在機體未受到特殊狀況影響的前提下（即啟動因素和複制環境相對穩定），肝細胞内HBV cccDNA水平是決定HBV cccDNA複制能力的關鍵因素。因此，了解肝組織内HBV cccDNA水平有助于臨床醫生判斷何時停用抗病毒藥物及預測停止治療後HBV是否會重新複制活躍并導緻乙型肝炎複發。

唐紅教授團隊前期研究發現，血清HBcrAg是反映肝内HBV cccDNA水平的較好替代指标，其準确性優于血清HBV RNA和HBsAg水平，因此目前認為血清HBcrAg可能是預測抗病毒治療停藥後是否複發的一個有效指标。

血清HBcrAg定量目前已被日本CHB指南推薦用于CHB患者核苷（酸）類似物停藥後病情複發的風險評估。對于接受核苷（酸）類似物持續抗病毒治療2年以上的患者，若停藥時血清HBV DNA和HBeAg均陰性時，可通過病毒抗原（即HBcrAg和HBsAg）水平評分來評估停藥後的複發風險。

在該評分系統中，根據停藥時血清HBsAg水平高低，分别給予0分（＜80 IU/ml）、1分（80~800 IU/ml）和2分（≥800 IU/ml）；根據停藥時血清HBcrAg水平高低，分别給予0分（＜3.0 log U/ml）、1分（3.0~4.0 log U/ml）和2分（≥4.0 log U/ml）。根據血清HBsAg和HBcrAg評分總和，可進一步将患者的停藥後複發風險分成3個級别，即低風險組（總評分0分）、中等風險組（總評分1~2分）和高風險組（總評分3~4分）。低風險組預測停藥成功的百分比為80%~90%，即患者可以考慮停藥，但仍需要警惕複發（因為仍有少數低風險患者後期仍可出現肝炎複發）。中等風險組預測停藥成功的百分比近50%，即患者根據病情可以考慮停藥，但有必要做進一步考慮關于将來停藥的條件和方式。高風險組預測停藥成功的百分比僅為10%~20%，推薦繼續治療。

需要注意的是，血清HBsAg和HBcrAg間并不存在顯著的相關性，對于血清HBsAg水平低于80 IU/ml的CHB患者，其血清HBcrAg水平可能仍處于較高水平；同樣對于血清HBcrAg＜3 log U/ml的患者，其血清HBsAg水平可能仍處于較高水平。因此，僅根據血清HBsAg或血清HBcrAg水平來評估是否停藥可能存在不足。

唐紅教授團隊通過對接受8年核苷（酸）類似物治療的CHB患者外周血HBsAg和HBcrAg水平進行檢測後發現，血清HBsAg和HBcrAg水平均随着抗病毒治療時間的延長呈逐漸降低的趨勢，在治療第8年時，9.57%的患者實現了血清HBsAg＜100 IU/ml和21.3%的患者實現了血清 HBcrAg＜3 log U/ml。但進一步根據血清HBsAg和HBcrAg水平對患者停藥複發風險進行評估時發現，低風險組僅3.2%，而中等風險組和高風險組患者卻高達34.0%和62.8%。這一結果似乎可以解釋為何臨床上相當一部分血清HBsAg低水平甚至消失的CHB患者在停用抗病毒藥物之後短期内即可出現肝炎複發，對于這部分患者若能夠同時檢測血清HBcrAg水平則或許有助于避免盲目樂觀的停藥決策。

4 血清HBcrAg可預測HCC發生及術後腫瘤複發

肝細胞的炎症刺激和HBV基因整合被認為是HCC發生的主要原因，而持續的cccDNA存在是HCC的高危因素。在HCC患者中，血清HBcrAg與肝内HBV cccDNA同樣存在較高的相關性，故有學者推測CHB患者外周血持續高水平HBcrAg可能與HCC的發生發展有關。

為了解血清HBcrAg水平是否與HCC發病率存在相關性，Tada等對1031例未接受治療的CHB患者進行了平均10.7年的随訪，發現血清HBcrAg在預測HCC發生方面優于血清HBV DNA和HBeAg，且HBcrAg>2.9 log U/ml是HCC發生的獨立預測因子［風險比=5.05，95%可信區間（95%CI）：2.40~10.63］。

Cheung等進一步通過對76 例接受核苷（酸）類似物治療後均檢測不到血清HBV DNA的CHB患者進行研究發現，與未發生HCC患者相比，HCC組治療前HBcrAg水平更高（5.45 log U/ml vs 4.55 log U/ml, P=0.005）；且治療前HBcrAg>4.67 log U/ml和治療後HBcrAg>3.89 log U/ml均能獨立預測HCC的發生。血清HBcrAg也被報道可用來預測HCC切除或射頻消融後的複發。

Hosaka等對55例核苷（酸）類似物治療期間發展為HCC并進行根治性切除術或經皮消融治療的患者進行研究發現，血清HBcrAg>4.8 log U/ml時，2年内HCC複發的危險比為8.96（95％CI：1.94~41.4）。

此外，近期發表的多項研究亦提示，在核苷（酸）類似物治療過程中，若CHB患者外周血HBcrAg持續處于高水平則更容易發展為HCC，而HBeAg血清轉化後3年内的高HBcrAg水平與CHB患者的HCC發展獨立相關。

由此可見，血清HBcrAg可預測HCC發生及術後腫瘤複發，因此在抗病毒治療過程中，在追求病毒學應答的同時，有必要将血清HBcrAg作為抗病毒療效的評價新指标，并盡可能将血清HBcrAg控制在最低水平以最大限度降低HCC的發生發展和術後HCC複發風險。

5 小結

血清HBcrAg是肝組織内HBV cccDNA較好的無創替代指标，其可能很快成為疾病監測、抗病毒療效評價和預測停藥複發和HCC發生發展的新标志物。但是作為一項新的指标，血清HBcrAg在我國臨床常規使用之前仍需要進行更廣泛的臨床驗證。