染色質免疫共沉澱（ChIP檢測）實驗流程
染色質免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation），是檢測轉錄因子等蛋白與DNA之間相互作用的主要實驗方法之一。在活細胞内使用甲醛将DNA和蛋白交聯，使用超聲将染色質切成很小的片斷，并沉澱下來。通過目的蛋白的抗體将蛋白免疫共沉澱，富集。通過定量PCR檢測使用特異性引物對蛋白可能結合的DNA進行擴增檢測。
實驗流程：
1、細胞交聯與超聲破碎
1 将細胞培養在15cm培養皿中，待細胞長到70%融合度時，根據實驗目的進行細胞處理。培養到指定時間點後，去除培養基，加入預冷的PBS洗一次後将細胞消化下來後轉移至15ml離心管中，1000rpm離心去除上清，加入5ml PBS緩沖液，加入甲醛至終濃度為1%，室溫置于搖床上輕輕晃動20min。加入2.5M Glycine至終濃度0.125M終止交聯。在4℃下輕輕晃動10min。在100g，4℃離心5min。棄上清，加入10ml 預冷的PBS洗兩次，離心去除上清。
2 加入2 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl 蛋白酶抑制劑）重懸細胞。冰上孵育15min，每隔5min振蕩一下細胞懸液。孵育之後，用Dounce勻漿器将細胞懸液勻漿化10次以促進核釋放。
3 4℃800 g離心5 min。去除上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5μl蛋白酶抑制劑）重懸細胞。
4 超聲破碎：使用超聲儀在中檔，沖擊13s，冰上放置45s，共6次。取5μl細胞裂解液進行電泳檢測未打斷的DNA。
5 4℃12000rpm離心10 min除去不溶解的沉澱。将上清液轉移至心的EP管中，分為50μl一份。
2、免疫共沉澱
1每個IP實驗需要450μl Dilution Buffer和2.25μl蛋白酶抑制劑。測試樣品包括：陽性對照Anti-Histone H3，陰性對照Normal Rabbit IgG，目的抗體。
2 超聲好的50μl樣本置于冰上，加入450μl稀釋液（含2.25μl蛋白酶抑制劑），輕輕混勻後，去除5μl凍存，作為input。
3 分别加入不同抗體和20μl混勻的protein A magnetic beads。
陽性對照抗體，4.0 μg抗體每管。
陰性對照IgG，5.0 μg抗體每管。
目的抗體，每管加5.0 μg抗體。
4 4℃旋轉孵育過夜。
5 使用磁力架将Protein A magnetic beads沉澱下來，輕輕去除上清。
6 加入0.5ml預冷的緩沖液，在旋轉台上孵育5min後置于磁力架上，去除上清。
7 低鹽清洗緩沖液、高鹽清洗緩沖液、LiCl清洗緩沖液、TE緩沖液分别洗1次，每次5min。将樣本置于磁力架上，去除上清。
8 洗脫Protein/DNA複合物和反交聯Protein/DNA複合物為單獨的DNA。
9 加入100μl ChIP清洗緩沖液，62℃振蕩孵育2 h
10 95℃孵育10 min。然後将樣品置于室溫冷卻。
11 将樣本置于磁力架上，将上清液移到一個新的管子中。
3、DNA純化
1 将0.5 ml Bind Reagent A加入每個100 μl的DNA樣品管中并混勻。将樣本轉移至離心柱上管中，12000rpm離心1min。去除下管液體。
2 加入0.5 ml Wash Reagent至離心柱上管中，12000rpm離心1min。去除下管液體。
3 12000rpm離心2min。丢棄下管。将上管置于新的管中，在離心柱上加入50μl Elution buffer，常溫放置2min，12000rpm離心1min。
4 去除離心柱，下管加入20μl洗脫液就是純化的DNA，直接用于定了PCR檢測或存于-20℃。
4、定量PCR檢測
1 使用紫外分光光度計檢測純化DNA含量
2 PCR體系：
| 試劑 | 體積 |
| DNA | 2µL |
| PCR上遊引物（10µM） | 0.4 µL |
| PCR下遊引物（10µM） | 0.4 µL |
| SYBR Green solution | 10 µL |
| 滅菌雙蒸水 | 7.2 µL |
| 總量 | 20 µL |
3 定量PCR檢測
反應條件：
| 95.0 ℃ | 10min | |
| 95.0 ℃ | 15 s | 40 cycles |
| 60.0 ℃ | 1min | |
| 95.0 ℃ | 15 s | melt curve |
| 60.0 ℃ | 1 min | |
| 95.0 ℃ | 15 s |
實驗結果示例：
A ChIP檢測DNA跑膠示例圖。B ChIP檢測結果分析示例圖。C ChIP檢測擴增曲線示例圖。D ChIP檢測溶解曲線示例圖。
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