陶軍:内皮微顆粒:囊泡轉運與血管功能調控·365醫學網

微顆粒（Microparticles，MPs）是細胞激活、損傷或凋亡時從漿膜上通過出芽方式形成并進入循環的、攜帶來自母細胞某些抗原特性的亞微米級囊泡 。 MPs是胞外囊泡的一種，胞外囊泡根據直徑大小分為：外泌體（30-100nm）、MPs（100nm-1μm）和凋亡小體（1μm-4μm）。在内穩态失衡時，血管内皮細胞與其他細胞一樣能釋放膜囊泡——EMPs，調控血管功能。本文将對EMPs與血管功能調控做一簡單綜述。

1、 EMPs的特征

　 所有類型的血細胞都可以釋放MPs，其中血小闆來源的MPs（platelet microparticles, PMPs）數量最多，其在19世紀60年代被發現并稱之為“血小闆塵埃（Platelet Dust）”，具有很強的促凝血作用。EMPs由内皮細胞胞膜出泡所形成，EMPs漿膜表面表達一系列與凝血反應、細胞增殖和凋亡、炎症反應、氧化應激、細胞粘附、蛋白水解、新生血管形成及腫瘤增殖等相關的信号分子，如血管内皮鈣粘蛋白（vascular endothelial cadherin），血小闆内皮細胞黏附分子（platelet endothelial cell adhesion molecule-1），細胞間黏附分子（intercellular cell adhesion molecule, ICAM-1），内皮素（endoglin），E選擇素（E-selectin），黑色素瘤黏附分子（Melanoma Cell Adhesion Molecule, Mel-CAM）或整合素（integrin） 。通過檢測這些表面分子能夠鑒定出EMPs。但除了E-選擇素和血管内皮鈣粘蛋白外，大部分都是非内皮特異性的。因此，需要聯合檢測多種表面分子以排除其他微顆粒亞群的幹擾，提高特異性和敏感性。MPs帶有從母細胞獲得的功能性受體、蛋白質、生物活性脂類和核酸物質，在細胞間信号傳遞中起信使和效應器的作用。EMPs的蛋白組成高度依賴于刺激物的種類。EMPs蛋白組學研究發現EMPs内含有一定數量來自母細胞内質網、線粒體和核糖體的蛋白質，提示母細胞的細胞器參與MPs的形成過程 。目前仍然缺乏EMPs脂質組學的研究。Valadi等首次發現肥大細胞産生的外泌體（exosomes）中含有非編碼miRNAs，并且能夠傳遞給靶細胞 。從健康人血漿中分離出來的MPs和外泌體含有miRNAs。間充質幹細胞來源的MPs含有核糖體蛋白，參與胞内RNA的儲藏及運輸，表明MPs可能在胞内不同區域間傳遞RNA等核酸物質 。由上述證據可見，EMPs能通過向靶細胞轉運RNAs發揮生物學作用。miRNAs是如何選擇性裝入囊泡中以及如何轉運、識别和被靶細胞利用需要進一步深入的研究。
　 一項針對胚胎幹細胞來源的MPs刺激造血祖細胞增殖分化的研究首次發現胞外微囊泡能攜帶并向靶細胞傳遞信号分子 。胚胎幹細胞來源的MPs通過激活p42/44和Akt通路誘導早期多能幹細胞和造血幹細胞的分化。與來源的胚胎幹細胞相比，MPs攜帶有更多的Wnt3蛋白和多能轉錄因子的mRNA，并且這些mRNA能直接傳遞或翻譯成蛋白質進入靶造血幹細胞。
　 Hergenreider等人研究證明内皮細胞高表達抗動脈粥樣硬化相關轉錄因子KLF2或在切應力作用下能提高釋放的EMPs中miR-143 和miR-145的含量。這些EMPs能将攜帶的miR-143/145轉運至目标平滑肌細胞（Smooth Muscle Cell,SMCs）中，調節SMCs基因的表達水平 , 。另外，EMPs将功能性microRNA-126運載至内皮細胞，調節目标SPRED1蛋白，促進血管内皮修複 。

2、 EMPs的形成和釋放機制

　 内皮細胞在受到激活或者凋亡時，胞内鈣濃度上升，激活拼接酶（Scramblase）和鈣蛋 白酶（Calpain）并抑制移位酶（Translocase），破壞胞膜磷脂雙分子層的不對稱性分布，使磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）暴露出來，細胞膜骨架蛋白重構，EMPs形成 。與血管内穩态相關的促炎因子，促凋亡因子，促凝血因子以及變性脂質和毒素，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α） ，C-反應蛋白（CRP） ，凝血酶（thrombin） ，纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1） ，血管緊張素II（Angiotensin II，Ang II） ，細菌脂多糖（LPS） ，尿毒毒素 ，三氧化二砷 和氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL） 均能刺激體外培養的内皮細胞釋放EMPs。但目前仍然缺乏上述生物因子在體刺激EMPs釋放機制的研究。Boulanger等發現低切應力和終末期腎病患者體内EMPs水平相關 ，Vion AC等進一步研究發現，低切應力通過激活ROCK(Rho kinases，ρ激酶)和ERK 1/2(extracellular signal-regulated kinase，細胞外信号調節激酶)刺激EMPs釋放而高切應力通過NO介導調節ABCA1（ATP-binding cassette transporter A1, ATP結合盒轉運蛋白A1）表達及細胞骨架重構限制EMPs釋放 ，表明血流動力學改變也能刺激EMPs的釋放。
　 目前針對EMPs形成與釋放的分子調控機制研究仍然缺乏。Sapet等人利用微陣列分析技術研究EMPs形成的基因轉錄過程，發現凝血酶刺激後，微血管内皮細胞中與細胞骨架重構相關的基因表達增強，其關鍵信号通路是NF-κB-Rho kinase (ROCK) II -caspase-213，利用細胞松弛素B（Cytochalasin B）阻斷該通路，抑制細胞骨架微絲形成能減少MPs的釋放5。ROCK的激活與血管重構及高血壓病密切相關 ，利用ROCK抑制劑減少EMPs生成可能成為改善血管功能異常的新手段。Simoncini等人研究發現凝血酶刺激内皮細胞後，TNFα超家族成員—可溶型腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand, TRAIL）釋放增加，TRAIL與TRAIL-R2結合，啟動下遊轉錄因子NF-κB，導緻EMPs的釋放，敲除TRAIL基因的内皮細胞在凝血酶刺激下EMPs釋放顯著減少，表明TRAIL是EMPs釋放的關鍵信号分子 。利用甲基β環糊精（methyl-β-cyclodextrin ，MBC）和制黴菌素破壞胞膜上的脂質筏（lipid rafts），會導緻EMPs水平降低，表明脂質筏可能是EMPs形成的膜位點。
　 有人提出胞内調控EMPs釋放的信号通路與炎性反應密切相關。Curtis等人發現p38-MAPK通路與TNFα介導的促炎性反應EMPs釋放有關，口服抗血小闆藥物氯吡格雷作用于p38-MAPK信号通路，能減少體外培養人臍靜脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs）形成MPs ，證實p38-MAPK信号通路參與了EMPs的生成 。

3 EMPs的生物學效應

3.1 EMPs促進凝血和血栓形成
　 在動脈粥樣硬化斑塊中及急性冠脈綜合征患者體内均發現具有促凝血功能的EMPs存在。EMPs表面有帶負電荷的磷脂，尤其是磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）與凝血因子帶正電荷的γ-羧基谷氨酸結構域相結合，為凝血因子形成複合物提供錨定位點，能啟動瀑布式凝血反應 ，表明EMPs具有促進凝血的作用。另外，多項體外實驗研究已經發現TF 的EMPs亞群11,15,18。組織因子（Tissue factor，TF）與因子Ⅶ/ Ⅶa 結合後啟動外源性凝血級聯反應 。EMPs通過表面的組織因子介導促凝血反應和血栓形成已經被确認 。TF EMPs表達内皮黏附分子和ICAM-1，與單核細胞表面的integrinβ2亞基相結合，将TF轉運到單核細胞上，增強其TF依賴的促凝血功能27, 。EMPs表面攜帶有蛋白酶，如TNF-α轉化酶（Tumor necrosis factor-alpha converting enzyme, TACE/ADAM17），能水解内皮細胞表面的跨膜蛋白，使内皮細胞蛋白C受體（endothelial protein C receptor, EPCR）脫落，抑制EPCR介導的抗凝作用，增強内皮細胞的促凝血功能 , , 。然而，最新研究發現EMPs表達尿激酶型纖溶酶原激活物（urokinase-type plasminogen activator， U-PA）及其受體介導纖溶酶的合成，起抗凝作用 。表明EMPs可能在凝血/抗凝血反應中起重要調節功能。

3.2 EMPs與炎症反應
　 炎性介質，如TNFα, IL-1β 和凝血酶等能刺激EMPs的生成，EMPs又以旁分泌的方式促進血管炎症的發生，形成瀑布樣炎性反應1。TNF-α刺激EMPs釋放的同時，EMPs分泌可溶型ICAM-1增加，放大内皮環境炎性反應。目前研究發現EMPs能反映細胞活化狀态及全身性炎症反應水平，提示EMPs可能是炎症反應的始動因素或産物。在健康年輕男性體内發現EMPs水平與IL-6及CRP濃度相關，表明EMPs的形成與低水平炎症反應有關 。動脈粥樣硬化、糖尿病和自身免疫性疾病（如多發性硬化及SLE）等存在炎症反應病理基礎的疾病患者體内循環EMPs水平升高，提示長期慢性炎症可能促進EMPs的釋放。EMPs促進炎症反應的發生并形成瀑布樣級聯反應的機制目前尚未明确。在體外，EMPs通過向幼稚内皮細胞傳遞ICAM-1 mRNA、轉錄因子和miRNA上調ICAM-1基因的轉錄和翻譯，促進炎症反應25。研究發現，給小鼠靜脈注射EMPs後，其血液及肺泡中的IL-1β 和TNFα濃度升高，同時向肺泡趨化的中性粒細胞數量明顯增多。由于IL-1β缺乏分泌信号肽，MPs轉運機制在ATP活化的肥大細胞外分泌IL-1β中起到重要作用 。

3.3 EMPs和新生血管形成
　 新生血管形成是在内皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）等細胞因子信号通路調控下由原有的脈管系統形成新的毛細血管。有研究表明，T淋巴細胞來源的MPs（T-lymphocyte-derived microparticles, TMP）促進ROS生成，抑制血管新生和内皮細胞功能 。目前大部分研究顯示EMPs抑制血管生成，但具體機制不明。HUVECs來源的EMPs抑制血管生成的作用能被胞膜的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）阻斷，表明ROS在EMPs抑制血管生成中起重要作用 。給予高脂飲食Ldlr-/-小鼠靜脈注射EMPs，發現其通過影響eNOS和NO的合成抑制心髒血管的再生 。2型糖尿病患者疾病嚴重程度與EMPs水平呈正相關。最近一項針對健康人和2型糖尿病患者血漿MPs對于内皮血管新生作用的研究發現， 2型糖尿病合并冠狀動脈病患者血漿MPs抑制内皮新生血管形成 ，表明EMPs抑制血管生成，加重存在血管生成障礙病理基礎的疾病如糖尿病等的嚴重程度。然而，有另外一些研究得出相反的結論。Leroyer等研究發現CD40 MPs能通過誘導VEGF的表達和激活PI3K/AKT信号通路，刺激内皮增殖，促進在體新生血管的生成，導緻動脈粥樣硬化斑塊内出血 。EMPs表面的integrnα4 和β1（integrins α4 andβ1）為其與内皮細胞的識别和結合提供了錨定位點，将mRNA傳遞給内皮細胞，通過磷酸化作用激活PI3K-Akt通路和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，促進血管新生 。

4 EMPs—血管功能損傷的新指标
　 1999年首次發現在患者體内MPs水平明顯升高11，并提出MPs可能是疾病診斷和預
後的新指标。内皮細胞激活或凋亡時最早的生物學反應之一就是囊泡的釋放。雖然EMPs隻占循環MPs很少一部分，但其血漿水平的變化對于評估血管功能損傷和心血管疾病具有重要意義。在急性冠脈綜合征（ACS）、動脈粥樣硬化、卒中、高膽固醇血症、代謝綜合征、肥胖、糖尿病、外周血管病、高血壓和心衰等存在血管壁病理基礎的疾病中，循環EMP的水平明顯升高，提示EMPs與血管疾病的發生和轉歸相關42-48。一項涉及350名心血管疾病高危患者的前瞻性研究發現VE-cadherin (CD144 ) EMPs 是心血管事件發生的獨立預測因子，聯合其他标志物（如BNP、hsCRP等）能有效預測高危患者心血管事件的發生幾率 。肺動脈高壓患者CD62e （E-selectin）EMPs計數（＞353/µl）與不良事件的發生呈正相關。EPCs具有修複内皮損傷的作用，EPCs和EMPs的平衡能維持血管内皮完整性，保護内皮功能。多項研究證實EMPs與EPCs的比值是高危人群血管功能的評價指标45, 。ST段擡高性心梗（ST segment elevation myocardial infarction, STEMI）患者責任動脈内的EMPs水平明顯高于循環，且與血栓積分（thrombus score）相關，同時，責任動脈内的EMPs與STEMI患者pPCI術後微動脈栓塞（microvascular obstruction，MVO）預測指标直接相關 。
　 現有的血管功能檢測方法有血流介導舒張功能（Flow-Mediated Dilatation）、血管造影乙酰膽堿灌注、脈搏波速度（Pulse Wave Velocity）和生物分子指标。Boulanger等人在終末期腎病患者中發現，EMP的水平與FMD下降程度高度相關(r=-0.54，P=0.004) 。我們課題組的一項關于高血壓病患者循環内皮微顆粒水平和動脈彈性功能的關系的研究發現，EMPs水平與肱踝PWV呈正相關 (r=0.42，P＜0.001) 。這些指标隻能評估血管某一方面的功能，而EMPs作為血管分子病理學指标能綜合反映血管内穩态狀況 。因此，EMPs可能成為血管内皮功能障礙新的生物學标記物。

5 EMPs與血管功能和内皮穩态調控
　 EMPs參與促凝/抗凝反應、炎性反應和内皮損傷修複/凋亡，對内皮微環境穩态和血管功能起調控作用。内皮微環境是炎症反應、凝血反應、血管舒縮活動、血管新生和重構等血管生物學行為發生的場所。EMPs能通過形成不同的亞群，利用不同的信号通路調控上述血管生物學行為。最初的研究結論是EMPs可反映内皮細胞功能障礙，并通過促炎、促凝、抑制NO産生等方式參與内皮細胞損傷。然而，有最新研究表明EMPs具有内皮保護及抗凋亡的作用。Mause等人研究發現PMPs通過上調早期成血管細胞（Angiogenic early outgrowth cells, EOCs）表面内皮标志物的表達，轉移基質細胞衍生因子受體(Cxc Chemokin Receptor 4, CXCR4)至EOCs，增強其與配體CXCL12/SDF-1α的相互作用，提高EOCs的增殖、遷移及分泌成血管因子的能力，修複血管内皮損傷 。Abid Hussein等人研究發現EMPs通過阻斷内皮細胞caspase-3，阻止内皮細胞凋亡，首次證明EMPs具有抗凋亡作用 。EMPs攜帶EPCR和活化蛋白C（activated protein C, APC）具有細胞保護和抗炎效應，維持内皮細胞存活 。
　 NO是最重要的血管舒縮功能調控因子。EMPs可能通過調控NO的生成和生物利用度對血管功能起負性作用。在急性肺損傷時，纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen activator inhibitor, PAI-1）刺激産生的EMPs通過抑制内皮介導的血管舒張功能和減少eNOS合成的NO加重肺損傷 。王潔梅等發現CRP刺激HUVECs産生的EMPs能抑制四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin, BH4）依賴性NO的合成 。在缺氧條件下， MPs通過調節NOS的磷酸化水平，抑制NO合成，損傷血管舒張功能。在健康人體内，短時間二手煙吸入導緻血管内皮急性損傷的同時，EMPs的水平顯著降低，NO釋放減少，EPCs功能受到抑制 。
　 EMPs通過調節内皮穩态發揮一系列的生物學效應。EMPs參與炎症反應、促凝血反應和新生血管形成等負性生物學行為，然而其也有維持内皮穩态的作用。出現這種矛盾的原因在于EMPs結構及組成的複雜性，蛋白組學分析表面1/3的EMPs蛋白高度依賴于刺激物的種類，從而形成具有不同表型的EMPs亞群。整合上述研究結果發現，不同表型的EMPs在内皮穩态調節中發揮不同作用。

6 結語

　 大量實驗研究證明，EMPs在血管功能信号調控中起重要作用。同時，囊泡通過複雜有
效的分子調控機制調節細胞内環境的穩态。EMPs調節異常可以作為血管功能障礙的預警信号。人們希望降低心血管危險因素能減少EMPs的形成，從而改善預後。目前正在進行的多項大型多中心臨床研究将會探究囊泡轉運在血管功能調控中的重要意義。充分闡述囊泡的生成、生物學效應及其在疾病發生發展中的作用将有助于深入理解EMPs與血管功能的關系。