為了研究某個基因在體内的功能,通常需要将該基因敲除,再觀察其出現哪些異常現象,推測該基因具有何種功能。
然而,有些基因對小鼠個體很重要,敲除後會導緻小鼠不能存活、不能正常發育、繁殖能力異常,這時就不能進行全身性基因敲除。或者,研究者想研究某個基因僅在某個器官、某個時期缺失後有什麼功能,也是不能用全身性基因敲除的。針對這類研究,我們需要使用條件性基因敲除的方法進行研究。
1“條件性”是指什麼?
條件性基因敲除的“條件性”,是指在基因敲除的“時”、“空” 。
“時” 即時間、階段,是指可以人為決定基因在什麼時間、或什麼發育階段發生敲除,在此之前,基因仍可以發揮正常的功能。
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▲小鼠生長時間表
“空” 即空間、部位,是指可以人為決定基因在哪種組織、哪種器官,在其他的部位,該基因仍可以發揮正常的功能。
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▲小鼠内部結構圖
若希望“條件性的”基因敲除可遺傳給後代,必須同時滿足以下3個條件:
①基因敲除後小鼠仍具有正常生殖能力;
②基因敲除發生在生殖細胞内;
③小鼠交配行為發生在基因敲除之後。
2條件性基因敲除的兩個強有力的工具
條件性基因敲除基于兩個強有力的工具:
一是Cre/loxP重組酶系統;
二是基因打靶技術。
●Cre/loxP重組酶系統:
Cre重組酶來自于噬菌體P1,能夠催化兩個34bp長的loxP識别位點間的重組。
loxP由8bp的中心序列和兩側的13bp的回文序列構成,中心序列的不對稱性賦予loxP位點以方向。
Cre/loxP系統用于條件性敲除小鼠已經超過20年,cre小鼠資源比較豐富,僅Jackson lab上就有近800種Cre小鼠,MGI網站上更是收錄了超過3000種Cre小鼠,幾乎涵蓋了各種“時”、“空”的條件,因此制備條件性基因敲除小鼠首選Cre/loxP系統。
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▲loxP序列
除了Cre/loxP系統, 另外兩種Flpe/FRT系統、Dre/Rox系統也可以用于位點特異的基因重組/敲除,這兩個系統的作用機制和Cre/loxP系統類似,但重組效率稍低。
3Cre/loxP系統介導的基因重組的方式
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Cre/loxP系統介導的4種基因重組方式都是可逆的,但第①種重組方式更傾向于删除loxP間的序列。
條件性基因敲除正是利用了第①種重組方式。首先通過基因打靶的方法将2個loxP序列置于某個基因的重要外顯子的兩側,再通過小鼠交配的方法,在“條件性”表達Cre酶的細胞内,将重要外顯子删除,從而使該基因發生敲除。而未表達Cre酶的細胞内,該基因将不受影響,正常表達。
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▲利用同源重組的方法引入loxP的過程。
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