食用菌母種生産技術

食用菌母種生産技術

母種生産主要包括培養基制備、純種分離或轉管擴大、培養等環節。
一、母種培養基制備
1.母種培養基常用配方
（1）PDA培養基：馬鈴薯(去皮，下同)200克，葡萄糖20克，瓊脂18-20克，水l000毫升。
（2）加富PDA培養基
①綜合PDA培養基：馬鈴薯200克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀3克，硫酸鎂1.5克，維生素B110毫克，瓊脂18-20克，水1000毫升。
②蛋白胨－綜合PDA培養基：在加富PDA培養基①中添加5克蛋白胨。
③麥麸－PDA培養基：在培養基（1）中添加100克麥麸。
④麥芽汁－PDA培養基：在培養基（1）中添加50克大麥芽。
（3）鮮蘑菇浸出液培養基：鮮蘑菇200-250克，葡萄糖20克，瓊脂18-20克，水1000毫升。将蘑菇切碎，煮30分鐘，取其液汁。
（4）糞汁培養基：幹馬糞或牛糞150克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升。将馬糞或牛糞打碎，煮沸30分鐘，取其溶液。
（5）完全培養基（CM）培養基：蛋白胨2克，葡萄糖20克，磷酸二氫鉀0.46克，硫酸鎂0.5克，磷酸氫二鉀1克，瓊脂18-20克，水1000毫升。
2.母種培養基制作方法
不同配方培養其制作方法基本相同，現以綜合PDA培養基為例介紹其制作方法。
（1）培養基制作。将土豆洗淨、去皮、挖去芽眼及變青綠部分，稱取200克，切成約長寬各2厘米厚3毫米左右的薄片，在1200毫升水煮沸10－15分鐘，然後用4－6層紗布過濾，倒掉殘渣并洗淨鋁鍋。将濾液倒入鍋内，加清水補足1000毫升，同時放入瓊脂并重新開始加熱，最好小火加熱，不斷攪拌至瓊脂完全溶化，再用紗布過濾一次，補水至1000毫升。最後依次将稱好的葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和維生素加入，繼續加熱并攪拌至全部溶化，停止加熱。如果要加入蛋白胨需将蛋白胨用冷水溶化後加入，可以避免蛋白胨因結塊而分散不均。
圖3－11試管分裝
（2）分裝試管。左手持3-4支試管，管口朝上，令下端整齊，上移試管至漏鬥軟管，插入試管内約3厘米。右手捏緊軟管止流夾，使培養基液體流入試管，準确掌握液體培養基裝入試管的數量，直立試管時液體高度約為試管長度的l／5即可。此時松開止流夾液體停止流入。将試管下移離開軟管，再分裝第2支試管，周而複始，直至全部裝完。分裝試管要求速度快，尤其在低溫季節操作，以防止培養基凝固。裝量要準确，因為裝量偏多擺成的斜面變短，又浪費培養基。裝入量偏少則使擺成的斜面太薄，營養少，菌絲難以正常生長。注意避免将培養基沾附到試管管口，以免造成粘着棉塞現象，還易引起棉塞上滋生雜菌，給菌種質量留下隐患（圖3－11）。
圖3－12棉塞制作步驟
（3）棉塞制作。試管分裝好後，要塞好棉塞，棉塞要用普通棉花，不能用脫脂棉。棉塞制作方法多樣，現介紹一種常用制作方法：取棉花适量，做成一均勻片（步驟1），從一邊向裡折疊，使之成為一條整齊的邊（步驟2）。再将相鄰的另一邊向裡折疊，使第二邊與和第一邊成直角（步驟3）。順着第二邊将棉花卷緊（步驟4），成為柱形，末端的棉絮自然平貼在棉柱上（步驟5）。将毛茬的一邊折轉平貼在棉柱上（步驟6），将此端塞入試管口。棉塞的2/3塞入試管中，管外留1/3（步驟7），制作過程如圖3－12所示。（4）試管包紮。試管塞好棉塞後，取7支同樣規格的試管，用牛皮紙或雙層報紙将棉塞端包住，并向下延伸到試管中部，用粗棉線将其紮成一把。
（5）培養基滅菌。母種培養基多采用手提式高壓滅菌鍋進行滅菌，滅菌操作過程如下：
①檢查高壓蒸汽滅菌鍋的壓力表及各部位是否靈活、可靠，尤其注意檢查安全閥是否發生堵塞或鏽死。
②加水。在鍋内加入約3千克自來水，加至支架下緣。
③裝培養基。将捆好的培養基棉塞向上垂直放入滅菌筐（桶）。
④封蓋。将鍋蓋上垂下的排氣管插入套筒内壁的導氣管中，然後用雙手同時用力，分别将對角線方向的兩個螺絲擰緊。
⑤排冷空氣。封蓋後關閉排氣閥開始加熱，當加熱至壓力達0.05兆帕時，打開排汽閥，排盡冷空氣，待壓力降至零後，即可關閉排氣閥。最好依上法排兩次。繼續加熱，當壓力升至0.11兆帕時，開始計時，在0.11－0.14兆帕壓力下保持30分鐘，停止加熱。使其自行冷卻降壓至0。打開排汽閥，再将鍋門打開一條10厘米左右的縫隙，利用鍋體餘熱将棉塞烘幹。如果不進行棉塞烘幹的程序，棉塞潮濕易滋生黴菌。
圖3－13擺放斜面
（6）擺放斜面。觀察到報紙幹燥後，打開鍋蓋，當培養基溫度降到60℃左右時及時取出擺放斜面。如果在桌上放置1厘米高的小木條，将試管斜放其上，擺成斜面。注意培養基要蓋住試管底，斜面長度應以試管長度的1/2左右為好，最多不超過試管長度的3/4（圖3－13）。當試管内培養基完全凝固後收起備用。制備好的培養基應放置在通風幹燥處保存。如果溫度很高時就擺放斜面，培養基凝固後表面會出現較多的冷凝水，不利菌絲生長。在擺放好斜面後，用厚實的棉布覆蓋住培養基，使培養基緩慢降溫冷卻，也可減少冷凝水出現。
（7）無菌檢查。随機抽取幾支試管放入37℃左右恒溫箱中培養2-3天，若無雜菌生長便可放心使用。
（8）滅菌鍋的維護。滅菌結束後，應趁熱将國内餘水倒掉，當鍋内壁幹燥後蓋好鍋蓋，将表面擦拭幹淨後妥善保存。

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二、純種分離
采用無菌操作的方法，利用雙孢菇的子實體組織、孢子或菌絲束進行分離純化，經過培養獲得純菌種的方法叫純種分離。純種分離方法主要有組織分離法、孢子分離法和菌絲束分離法。組織分離法屬于無性繁殖的方式，操作簡單，能夠保持親本的優良性狀，是生産中最常用的菌種分離方法；孢子分離法又分為多孢分離法和單孢分離法，一般用于菌種選育或雜交育種；菌絲束分離法不常用。
下面以組織分離法為例介紹純種分離的方法。
組織分離法是切取雙孢菇的一部分菇體組織，放在培養基上，培養出純菌種的方法。一般取菌肉組織作為分離物。
1.種菇選擇。種菇應從沒有嚴重病史的菇房内采集。采集種菇的菇床應該無病蟲害發生，菌絲生長健壯，出菇均勻，轉潮快。應選擇菇形圓整，菌蓋肥厚，表面光滑，菌柄粗壯，無雜菌感染，無病菌蟲害的前二茬單生菇作為種菇。一般選用内菌幕未破的8成熟的子實體做種菇。
2.接種場所的消毒。選擇在接種箱或淨化工作台上進行分離均可。在接種箱内分離前，應将解剖刀、接種鈎、待接種的母種培養基、酒精燈、火柴等放入接種箱内，用甲醛和高錳酸鉀（甲醛用量10－14毫升/立方米，高錳酸鉀用量5－7克/立方米）混合熏蒸30分鐘。在淨化工作台上分離前，應提前打開鼓風機30分鐘，排除台面上含有雜菌的空氣後再進行操作。
3.種菇消毒。将切去部分菌柄的種菇，用75%的酒精棉球進行表面消毒。
4.手及接種工具的消毒。用75%的酒精對雙手及接種工具進行消毒。
5.分離過程。将消毒後種菇帶到接種箱或淨化工作台内，點燃酒精燈，先将解剖刀、接種構進行灼燒滅菌，然後用手指将種菇縱向掰開，用冷卻後的解剖刀切取菌蓋與菌柄交接處的一小塊菌肉組織，切好後放在原處。組織塊大小應适中，一般長寬各為0.5厘米，厚約3毫米的。太大污染幾率提高，太小不易成活。放下解剖刀，左手拿一支母種培養基和半個蘑菇，右手拿起冷卻後的接種鈎，挑取切好的組織塊迅速轉移到斜面培養基中央，并用接種鈎輕壓以防滑動，塞好棉塞。重複以上操作，一般需分離7管以上。
6.寫标簽。分離結束後，将7支試管包紮成一把，在頂端報紙上注明品種名稱、分離日期等。
7.培養。将分離後的試管放置在24－25℃的恒溫培養箱中控溫培養3-4天，就可發現褐色組織塊（因多酚氧化酶反應而緻）上生出白色絨毛狀菌絲。繼續培養20天左右，菌絲即可長滿斜面。培養過程中應經常進行檢查，發現有細菌或者黴菌污染，以及菌絲生長異常的應及時淘汰。
8.純化。通過組織分離獲得的母種，及時從外觀看不到雜菌感染也不能直接用于生産原種，這是因為組織塊上可能潛伏着少量雜菌，所以需要經過純化才能用于下一步生産。純化過程同下述轉管過程。要求挑取遠離組織塊的菌絲進行轉接。
三、轉管擴大繁殖
轉管擴大繁殖母種簡稱轉管，是為了擴大母種數量，采用無菌操作技術，将母種中的一小塊菌絲（帶培養基）轉移到新的試管斜面上，菌絲蔓延長滿斜面後獲得繼代母種的方法。過程簡述如下：
1.母種選擇。選擇種性好，純度高，生長均勻，菌絲健壯濃密的母種進行轉管，特别要檢查棉塞是否有松動，棉塞上是否有雜菌。
2.接種場所的消毒。同上。
圖3－14母種轉接過程
3.母種消毒。用75％酒精棉球将試管外部擦拭—遍。4.手及工具的消毒。同上。
5.轉管過程。将選好的母種和斜面培養基兩支試管用左手大拇指和其它四指握住使中指位于兩試管間的空隙。斜面向上，并使它們處于水平位置。右手拿住接種鈎，在火焰上方進行灼燒，接種鈎上方可進入試管的部分都要進行灼燒，用右手小指、無名指和掌根同時拔掉兩個試管的棉塞，并用手指夾緊。以火焰灼燒試管口，灼燒時不斷轉動管口，燒死管口上可能附着的雜菌。将灼燒過的接種鈎伸入菌種管内，先接觸試管内壁，使其冷卻，再将其爬壁的氣生菌絲體鈎掉，并将培養基尖端最薄處約1厘米長的一段切斷，連同氣生菌絲體一并鈎出試管外，再将接種鈎重新伸進種源試管内将母種培養基連同斜面表層菌絲體挖取少許（約3－5毫米見方），用接種鈎托住慢慢外移。當接近試管口時，要迅速移出，經過火焰送入待接試管内斜面中間部位，并用接種鈎輕壓以防滑動。抽出接種鈎，灼燒管口，塞上棉塞。如此反複操作，1支母種可轉接30-50支試管。母種轉接過程如圖3－14。
6.培養。接種完成後，要将試管重新捆紮，并在每把牛皮紙上如實記錄品種名稱、接種時間以及操作人員姓名等事項。取出後放在25℃的恒溫培養箱中控溫培養20天左右菌絲即可長滿。培養過程中發現有雜菌感染或者生長異常的要及時淘汰。
由于雙孢菇菌絲的生長速度較慢，所以可以在一個母種斜面上轉接兩個菌絲塊，長滿試管的時間可以縮短1/2。

一、原種培養基制備
雙孢菇原種培養基常用的有麥粒培養基、腐熟糞草培養基和腐熟棉籽殼培養基。其中麥粒培養基最為常用，在麥粒培養基上菌絲生長速度快，菌絲生長旺盛，擴接栽培種或在栽培料上播種後具有生長點多、發菌快等特點，在生産中廣泛應用。
1.原種培養基配方
（1）麥粒培養基：小麥98%，石膏1％，碳酸鈣1%，含水量50％±1％，pH7.5－8.8。
（2）腐熟糞草培養基：腐熟麥稭或稻草（幹）77％，腐熟牛糞粉20％，石膏粉1％，碳酸鈣1％，石灰1％，含水量62％±1％，pH7.5。
（3）腐熟棉籽殼培養基：腐熟棉籽殼（幹）97％，石膏粉1％，碳酸鈣1％，石灰1％，含水量55％±1％，pH7.5。
2.原種培養基制作方法
（1）麥粒培養基制作方法
配方。見前述。
稱量。用500毫升的菌種瓶時，一般每瓶用小麥（幹）0.2千克左右，用750毫升的菌種瓶時，一般每瓶用小麥（幹）0.3千克左右。根據滅菌鍋的容量計算後稱量。
漂洗。用清水将麥粒漂洗2－3遍，除去灰塵、麥糠等雜物，同時也減少培養基中雜菌的基數。
圖3－15麥粒浸泡
浸泡。在制種的前一天下午，用1％的石灰水浸泡小麥，夏天一般浸泡10－12小時，春秋季氣溫低時浸泡15－20小時（圖3－15）。煮沸。小麥撈出後在煮麥鍋内煮沸，水沸騰後再煮20分鐘左右，當麥粒達到“無白心，不開花”的标準後及時撈出，瀝幹多餘水分。煮麥時加水不可偏少，麥粒成熟度是關系麥粒菌種制作成敗的關鍵。
晾曬。将麥粒攤開，晾去表面水分，麥粒不沾手時及時收起。
加輔料。把石膏、石灰按比例加入，攪拌均勻。
裝瓶、加棉塞。麥粒裝至瓶肩即可，棉塞大小、松緊度要适宜。
滅菌。采用高壓滅菌，滅菌過程參照母種的滅菌，不過，由于麥粒培養基中雜菌基數大，培養基體積大，熱不易穿透，控溫滅菌時間應保持在2－2.5小時，才能保證滅菌徹底。滅菌是否徹底是影響制種成功率的關鍵(圖3－16)。
冷卻。滅菌結束後，自然冷卻，當壓力回複到0時，打開鍋蓋，利用鍋體餘熱烘幹棉塞，當培養基溫度降低到50℃左右時取出，放到幹淨的地方冷卻到常溫後才能接種。如果溫度很高時就取出培養基，瓶内麥粒上會有大量的冷凝水，對菌絲生長不利。
（2）腐熟糞草培養基制作方法
配方。見上述。
拌料。将發酵後的麥稭或稻草切成2－3厘米的草段，加入牛糞粉、石膏、石灰、碳酸鈣等輔料後充分攪拌均勻，加水調整含水量，使含水量達到62％左右。拌料後讓培養料吸水平衡2－3小時，再攪拌均勻後即可裝瓶。
裝瓶、滅菌過程同麥粒培養基制作。由于500毫升菌種瓶瓶口太小，所以一般用750毫升的菌種瓶。為加快菌絲生長速度，裝瓶要松緊适度，并用錐形棒在中間打孔直至瓶底。滅菌前要擦洗幹淨瓶上的碎料，特别是瓶口處要清理幹淨。
（3）腐熟棉籽殼原種培養基制作方法
配方。同上述。
②拌料、發酵。按照配方将培養料攪拌均勻，加水調整使含水量達到70％－75%，建成寬1.5米，高1.2－1.3米的梯形堆，長度依培養料數量而定，堆上打通氣孔。當料溫達到70℃左右時進行翻堆，要求将外層培養料翻到中間，中間溫度高的培養料翻到外圍，以利發酵均勻。以後每間隔3－4天翻堆一次，方法同前。每次翻堆後都要打通氣孔。發酵15－18天後，當培養料中出現大量高溫放線菌後終止發酵，直接用于裝瓶即可。也可以晾幹後貯藏備用。
③裝瓶、滅菌過程同腐熟糞草培養基制作。
二、原種的接種
将冷卻後的培養基裝入接種室，移入接種箱，同時放入母種和接種工具，用甲醛和高錳酸鉀（甲醛用量10－14毫升/立方米，高錳酸鉀用量5－7克/立方米）混合熏蒸30分鐘。也可用氣霧消毒劑（5－7克/立方米）熏蒸。
圖3－16原種的接種
接種前，雙手經75％的酒精表面消毒後伸入接種箱，點燃酒精燈，對接種工具進行灼燒滅菌。然後将菌種瓶放到酒精等一側，松動棉塞。左手拿一支母種，右手拿接種鈎（鏟），右手小拇指和無名指夾住試管的棉塞并拔出，用接種鈎挑取1.2－1.5厘米見方的母種塊，再用小拇指和掌根取下瓶口的棉塞，迅速轉移到原種培養基的表面中央，一般菌絲面向上，重新蓋上試管和原種瓶的棉塞。重複以上操作，一般每支母種接種4－6瓶原種（圖3－16）。 三、原種的培養
培養室有條件的應調溫至24℃，空氣相對濕度65％，或者常溫發菌也可。培養室保持閉光、适量通風，盡量減少人員出入。
培養期間要作好病蟲害的檢查工作。糞草培養基原種一般在24-26℃下約40天即可發滿菌，麥粒基質約30天左右發滿。此時可暫存或出售。自用原種須在發滿菌後再繼續維持7天，此時是最佳菌齡。
栽培種需求量大，每平方米栽培面積需要栽培種1.5－2瓶。栽培種生産主要包括培養基制備、接種、培養和産品質量檢查等環節。
一、栽培種培養基制備
圖3－17裝瓶
蘑菇栽培種培養基的配方其配制與原種制作方法一緻，這裡不再重複，請參看原種制作方法。裝瓶時可以采用集中裝瓶法，首先将大量空瓶擺放整齊，用鐵鍁向瓶上方撒麥粒培養基，當多數的培養基達到500mL刻度時進行适當調整。這樣可以提高裝瓶速度（圖3－17）。
圖3－18栽培種的接種


采用高壓蒸汽滅菌時，方法同原種滅菌。由于栽培種生産量大，所以也可以采用常壓滅菌。采用常壓滅菌時，每次将大量培養基裝在滅菌筐内，集中堆放，用雙層薄膜覆蓋，采用鍋爐供熱蒸汽，100℃滅菌時間24小時，然後再悶10－12小時，去掉薄膜後緩慢冷卻到60℃左右時移到幹淨出冷卻至常溫。常壓滅菌可以提高滅菌效率，滿足生産中對栽培種的需要。
二、栽培種的接種
培養基滅菌結束後，一般應待其溫度自然降至28℃以下或常溫時，再移入接種箱或接種室内常規接種（圖3－18）。接種過程與原種接種相似，隻不過原種生産是将母種接入原種培養基，而栽培種生産是将原種接種到栽培種培養基。由于栽培種生産量大，所以，可以在接種室内進行接種。
接種時，拔去原種上的棉塞，用冷卻後的接種鏟将原種表面老化的菌種去掉，再将原種上層的1/3劃散，然後取下栽培種培養基上的棉塞，套上一個大小适宜的漏鬥，将少量原種倒入栽培種培養基中，使原種均勻分布于培養基表面，用下一瓶的棉塞塞住瓶口。反複進行以上操作，當已劃散的菌種用完後，再劃下面1/3的菌種，接完後再劃底層1/3菌種進行接種。一般每瓶原種接種栽培種30－50瓶。箱内菌種全部接完後移到培養室的培養架上進行培養，并注明品種名稱、接種日期、接種人姓名等。
三、栽培種的培養
培養室有條件的應調溫至24℃，溫度盡量不要超過28℃，空氣相對濕度低于65％。培養室應避光、适量通風（圖3－19）。要對栽培種進行常規檢查。對發生的各種污染，應嚴格剔出并移出培養室，分類處理。
培養期間要作好病蟲害的檢查工作。糞草培養基原種一般在24-25℃下約40天即可發滿菌，麥粒菌種約25－30天發滿。此時可暫存或出售。

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