諾獎青睐的觸覺研究是怎麼做出來的？ | Piezo封神之路（上）

2010年，美國Scripps研究所的Ardem Patapoutian課題組在《科學》雜志報道了哺乳動物中首類介導陽離子内流的機械門控離子通道——Piezo蛋白家族[1]，平地驚雷般的開啟了一個領域。因與觸覺等關鍵的基礎機械感覺關系密切，該蛋白自發現伊始便作為明星分子活躍在各大學術期刊上。Ardem更是因這一發現被授予2021年諾貝爾生理學或醫學獎！筆者的導師肖百位教授曾是Ardem的博後，他見證和參與了Piezo蛋白早期研究的關鍵工作，獨立後在這一領域繼續深耕，因而我有幸進入到這一熱火朝天的領域中。Piezo蛋白究竟是什麼？它們是如何工作的？它們的重要性在哪兒？帶着這些問題，讓我們一起進入Piezo的世界，一個科學家們逐步認識Piezo蛋白的過程。

圖1. Ardem Patapoutian因其在觸覺感知領域的重要貢獻獲得2021年諾貝爾生理學或醫學獎丨圖片來自諾貝爾獎委員會官網

我們對這個世界最初的感知通常是從觸覺開始的。第一聲啼哭之前，嬰兒經曆過誘發哭聲的拍打；來到人世，感受親人的愛撫和擁抱；兒時抓周一通亂摸，成長中提筆、拍球、彈撥樂器；日常生活中握手，敲擊鼠标鍵盤，刷手機……觸覺充斥着我們日常生活的方方面面。

觸覺是軀體機械感覺的一種，除了觸覺之外，還有機械痛（區别于日常的輕觸覺）、本體感覺（對四肢移動和體位的感知）等也屬于軀體機械感覺。這些機械感覺和視覺、嗅覺、味覺和聽覺構成了我們日常意義上的五感（聽覺也是感知聲波振動的一種機械感覺）。

圖2. 五種感覺丨圖片來自Bing

這些基本感覺從形成、傳遞到感知，生物學過程大體上是類似的：特定的感受器官和細胞上特定的受體接收外界刺激，産生動作電位，這種電信号沿神經突觸向中樞神經系統傳遞，最後到達大腦特定區域，就産生了特定的感覺。在這一過程中，作為最初級受體的一系列蛋白質是十分神奇的存在。

人體的蛋白質都是由20種基本的氨基酸組成。可就是僅僅憑借這20種基本組件的排列組合，生物居然能演化出如此精準強大的、感知外界各種物理化學信号的接收器——受體蛋白。以人類為例，眼睛中的光敏感受體可響應380-780nm波長的電磁波；鼻子中的嗅覺受體可幫助我們分辨出空氣中的數萬種小分子；味蕾上的味覺受體可分辨苦鹹酸甜鮮；人耳中聲波的受體可以分辨出各種不同響度、頻率和音色的聲音；遍布全身的觸覺受體能幫我們精确分辨出壓力、振動、紋理等多種不同的觸覺感受。而在動物中，這些受體的功能往往比人類更加強大。因此，鑒定出這些受體究竟由何種蛋白構成，一直都是神經科學家們孜孜以求的關鍵目标。

視覺上的研究首開先河，視網膜上的感光蛋白（視紫紅質）為德國科學家在19世紀發現，而後在上世紀80年代确定了全長DNA序列[2, 3]。接着，仿照研究視覺受體的辦法，科學家們相繼鑒定到嗅覺和味覺受體的分子基礎[4, 5]，其中嗅覺受體的工作獲得了2004年諾貝爾獎。這三種感覺的受體蛋白或在相應感官中高表達，或在基因序列上有高同源性（三者均屬于G蛋白偶聯受體家族），這兩個特點為它們的鑒定提供了條件。

至于餘下的兩種機械感覺，造物主似乎給我們出了難題：觸覺和聽覺的受體蛋白的低表達給生化鑒定帶來困難，且在基因序列上也不像視味嗅覺般有章可循[6]。憑借遺傳篩選，科學家得以在較低等的生物中鑒定到部分機械感覺通道(細菌中的機械通道MscL倒是生化方法獲得的[7])。

而在哺乳動物中，這個疑問一直持續到2010年。這一年，Ardem課題組鑒定到了哺乳動物中首類介導陽離子内流的機械門控Piezo陽離子通道[1]，解決了謎題。這一裡程碑式的發現為觸覺受體的分子基礎提供了可能的解釋。後續的研究發現，Piezo家族中的Piezo2确實參與觸覺感知。

如此重要的一類蛋白是如何千呼萬喚始出來的？它的功能是怎樣被一步步揭示出來的？今天，我們将從分子水平來講述Piezo這棟大廈的地基是如何打下的。

在當代生物學研究中，一個好的工作，往往都需要由淺入深的逐步上升到分子水平。具體來說，需要揭示這一過程的各個部分：一個生物學現象的組織器官基礎，與之相關的細胞，細胞上行使功能的蛋白，以及編碼該蛋白的基因。蛋白質和基因這種分子水平的研究是一個領域的基石。

電光火石——機械力能直接打開離子通道

哺乳動物細胞能産生數萬種蛋白，如何從中發現機械敏感蛋白？我們不妨先把問題轉化成：哪些蛋白可能響應機械力？

機械力勢必引發細胞形态的改變，因此，和細胞膜有密切關系的蛋白都能成為懷疑對象，包括直接定位在細胞膜上的膜蛋白、支持細胞結構的細胞骨架蛋白以及細胞外基質等。

1979年，研究人員用電生理的方法，在牛蛙的聽覺上皮細胞記錄到了機械力刺激下産生的電流[8]。由于刺激後電流産生的時間在亞毫秒級别（40μs），這個電光火石的瞬間不足以讓細胞内第二信使完成信号傳遞（上述的視覺嗅覺味覺的G蛋白偶聯受體就需要借助第二信使産生電流），所以隻能是目的蛋白受到機械力後直接産生了電流。這個潛在的機械敏感蛋白，最可能是離子通道[8, 9]。

離子通道是膜蛋白的一種，一般由跨越細胞膜内外的孔道區域和其他輔助元件組成。在受到适當刺激時，孔道區域可打開，依據離子通道對不同離子的選擇性和細胞膜内外不同離子的電化學梯度，使部分離子穿越細胞膜，帶來細胞膜電位的變化，或由離子自身參與信号傳遞而形成生物學效應。

無獨有偶，1984年，研究人員在雞的骨骼肌細胞中記錄到了由牽拉所緻的機械敏感電流，該電流也被認為由離子通道介導[10]。

搜尋範圍由此大大縮小——離子通道中就存在着機械敏感蛋白。

圖3. 機械力驅動離子通道打開完成陽離子内流丨圖片改編自Hoffman, et al., 2011, Nature[11]

上下求索——你究竟是誰？

和G蛋白偶聯受體家族不同，不同的離子通道在序列和功能上彼此之間差異巨大，唯一被認可的共性是：都含有兩次以上的跨膜區[1]（膜蛋白都需要插入細胞膜的跨膜區，來定位在細胞膜上，最常見的跨膜區是α螺旋）。

如何判定一個通道是機械門控離子通道呢？科學家們制定了以下幾條準則：該通道要能直接被機械力激活而無需通過中間信使；該通道參與機體機械傳導的過程；在非機械敏感細胞中表達該通道能賦予該細胞機械敏感性；該蛋白有成孔區和機械敏感區[12, 13]。

此等嚴苛的标準，加上機械敏感通道常常低表達的特性，使得常規生化手段束手無策，僅在高表達的細菌機械敏感通道MscL的鑒定中方有用武之地[7]。而後世找尋其他真核生物的機械通道大都經由遺傳篩選得到。遺傳篩選是基于中心法則——蛋白質是由基因編碼産生。在個體或者細胞中，讓感興趣的基因發生變異，從而導緻該基因對應的、行使生物學功能的蛋白質發生變異或不再表達，如果此時機械感覺相關的表現異常，那麼該基因就很能作為備選基因。

在易于進行遺傳操作的低等物種中，遺傳篩選幫助我們确認了部分機械門控離子通道，比如線蟲裡的DEG/ENaC通道[14, 15]、果蠅的NOMPC通道[16]。而在脊椎動物，尤其是哺乳動物中，要确定機械敏感蛋白，可以尋找這些低等物種機械通道的同源蛋白。但這種方法收效甚微：哺乳動物中或是不存在相關的同源基因，而有同源基因的，其表達的蛋白卻沒有機械敏感性。此前唯一确定的哺乳動物機械敏感蛋白——K2P家族的作用是使細胞超極化而變得更加“平靜”[17]，可是觸覺、聽覺過程需要讓細胞去極化而“興奮”起來。

那麼，我們苦苦找尋的這種受體究竟是什麼呢？

學界路漫漫，上下而求索。

平地驚雷——Piezo蛋白橫空出世

故事開始于十多年前。彼時，Ardem實驗室的博士後Bertrand Coste接下找尋哺乳動物機械門控離子通道這一極具挑戰的課題。此前他們已經知道一種鼠源神經母細胞瘤細胞系（N2A細胞）是有較強機械敏感性的：玻璃尖頭戳細胞的力刺激和抽吸細胞膜的力刺激均能引發穩定電流。他們試圖從這種細胞出發，尋找那個隐藏在重重迷霧裡的機械敏感通道。

細胞系易于在體外大量培養，且細胞之間一緻性很高，這樣的特點允許我們鑒定到細胞内高表達的基因。借助基因芯片，N2A細胞系内高表達的基因被确定。再結合離子通道“至少有兩次跨膜”這一特點，他們挑選出一系列備選基因。進一步的，他們用RNA幹擾技術逐個抑制備選基因表達，如果某個基因抑制後的N2A細胞失去機械敏感性，那麼該基因表達的蛋白極有可能就是那個受體。

事情就這樣成了！在Bertrand口中的那個“美妙的時刻”，列表中的第72個基因被抑制後，N2A的機械敏感電流顯著下降！這個原名Fam38A的基因後來被命名為Piezo1，同一家族的另一個蛋白Fam38B被命名為Piezo2。Piezo一詞起源于希臘語，有“壓力、擠壓”的意思，用它做名字，寓意該基因是壓力受體。

進一步的，他們将Piezo表達在幾無機械敏感性的HEK293T細胞系中，成功賦予其機械敏感性。同時，又在哺乳動物傳導機械感覺的背根神經節中，發現了Piezo2的高表達，提示了Piezo2和觸覺、痛覺感知的密切關系[1]。

圖4. 機械敏感蛋白Piezo1的鑒定（點擊看大圖） A，用“戳”的機械力刺激細胞的電生理實驗設置。記錄電極與細胞形成全細胞記錄模式，玻璃刺激電極在電驅動下戳細胞。B，上圖，在N2A細胞中，戳細胞可誘發内向電流。下圖，用RNAi技術抑制Piezo1表達後，N2A細胞的機械敏感電流大幅降低。C，過表達Piezo1的HEK293T細胞展示出顯著的機械敏感性。（圖B, C改編自Coste, et al., 2010, Science [1]）

這是一件平地驚雷的大事！從此哺乳動物機械力受體研究的曆史煥然一新！Piezo蛋白是哺乳動物細胞具有機械敏感性的充分必要條件！

然而，這個研究并不是完美的，它僅證明到Piezo是機械門控陽離子通道至關重要的部分。

那麼，Piezo蛋白就是那個通道嗎？

生化藝術——真的是通道

上述研究雖然證明了Piezo蛋白對于機械敏感電流的出現不可或缺，但不能排除一種可能：Piezo隻是這個機械敏感通道的一部分，僅有輔助和調節功能。那麼，Piezo本身就足以實現通透離子的通道功能嗎？或者說，Piezo蛋白就是這個機械敏感陽離子通道的通道區嗎？

一個證據來自果蠅。研究發現，果蠅Piezo和鼠的Piezo在一些和孔道直接相關的性質上有較大差異，比如通道的電導和抑制劑作用能力很不相同。這說明，Piezo的來源不同，孔道相關的電生理特性不同，這暗示着Piezo本身就是通道[18]。

而更直接的方法是：直接提取純的Piezo蛋白，并重組到人造的類似細胞膜的脂質體上。如果仍能記錄到電流，那便證據确鑿。

這就要求我們能提取出保持生理功能的Piezo蛋白——這個步驟稱為“蛋白純化”。

蛋白的純化需要依據每種蛋白的特點量身定制，膜蛋白提取更是其中很棘手的一類。Piezo是很大的蛋白：超過2500個氨基酸，預測有30次以上的跨膜[1]。并且，離子通道經常以多聚體形式發揮功能，使提純難度進一步增加。因此，Piezo蛋白的純化非生化功力深厚者不可為之。

彼時，Ardem實驗室的另一個博士後，肖百龍博士，憑借其紮實的生化技術，解決了這一難題。純化的鼠源Piezo1重組入人工脂質體後，确實記錄到了通道開放産生的電流，且該電流能被钌紅（一種廣譜陽離子通道抑制劑）阻斷[18]。後續的工作進一步證明了重組脂質體下的Piezo有機械敏感性[19]。

至此，Piezo蛋白可以被名正言順的稱為“機械門控Piezo離子通道”。

圖5. Piezo1是離子通道

A，純化的Piezo1蛋白的免疫印迹電泳圖（western blot），圖中黑色條帶即為Piezo1蛋白的條帶。B，上圖，将純化後的Piezo1蛋白重組到人工脂質體上後可記錄到通道開放事件。下圖，該通道開放事件可被廣譜陽離子通道阻斷劑钌紅（RR）所阻斷。 （圖片改編自Coste and Xiao, et al., 2012, Nature [18]）

眼見為實——電子顯微鏡下的三葉螺旋槳

Piezo通道在進化上是保守的，從植物到動物都有這一蛋白[1]。但在同一個體内，它和其他的蛋白都不相似。那這個全新的蛋白長什麼樣呢？它究竟有怎樣的架構，竟能感知機械力？以及，它是如何傳遞機械力，來打開通道的？

單單基于氨基酸一級序列的諸多猜測和實驗都不如親眼所見。此時，Piezo研究呼喚結構生物學登上舞台。

在首篇Piezo論文（2010年）問世後的兩三年，冷凍電子顯微鏡技術發生了質的飛躍。貝葉斯方法的引入和直接電子檢測相機（DDD）的使用，讓冷凍電鏡能夠解析近原子分辨率的蛋白質三維結構。2013年，加州大學舊金山分校（UCSF）的程亦凡博士率先使用冷凍電鏡解析了TRPV1離子通道（2021年諾貝爾生理或醫學獎的另一主角）近原子分辨率結構[20]，這為其他通道結構的解析打入了一針強心劑。

2013年，肖百龍博士來到清華大學組建實驗室，恰逢施一公、王宏偉等人布局、搭建了強大的冷凍電鏡平台。肖百龍決定與清華的結構研究者們合作解析Piezo通道的三維結構。并率先獲得了Piezo1的中等分辨率結構[21]。冷凍電鏡技術的突破同樣吸引了Ardem和Rod Mackinnon（2003年諾獎得主）的目光，二人随即也投入到Piezo結構解析的工作中。一切都如此順理成章——合适的人，合适的時間，合适的技術手段——接下來的幾年，三方（肖百龍/李雪明，Ardem Patapoutain/Andrew B. Ward，Rod Mackinnon）幾乎同時獲得了Piezo1的高分辨率結構[22-24]，而Piezo2的高分辨率結構也随後為肖/李合作解出[25]。

Piezo的造型十分獨特。它是由三個單體組成的三葉螺旋槳狀結構，多達114次跨膜，是已知跨膜次數最多的一類大型膜蛋白。蛋白單體前36次跨膜以每4個跨膜區組成一個單元，共有9個重複性的單元，最後兩個跨膜區被認為形成孔道。蛋白整體由外周槳葉部分向中心凹陷成穹頂狀（直徑28nm，深10nm），中心孔道區域上方有一胞外的帽子結構域（Cap），細胞内側有一9nm長的長杆結構（Beam），将槳葉外周連接到中心孔道的胞内部分[21-25]。

著名物理學家費曼說過：“你隻要看到它，你就能回答許多基本的生物學問題。”

Piezo通道這般别緻的結構能告訴我們什麼呢？

圖6. Piezo2冷凍電鏡三維結構卡通圖（圖片改編自Wang, et al., 2019, Nature [23]）

逐鹿中原——Piezo通道如何感知力？

結構決定功能，世間萬物大抵如此。

Piezo這個三葉螺旋槳打開過程中發生了怎樣的變化？研究人員有理有據的“腦洞大開”。

Piezo的外周槳葉能将周圍的細胞膜向内扭曲凹陷，而其他膜蛋白周圍的膜成分一般是平的，這一異乎尋常的現象讓研究人員們猜測：機械力作用在Piezo上的時候是不是會将該凹陷展平呢[26]？2003年諾獎得主Rod Mackinnon的課題組發表了兩篇文章，論證了展平的可行性以及模型[24, 27]，之後還利用原子力顯微鏡進一步驗證[28]。

依托結構導向的功能機制研究，肖百龍課題組發表了系列文章來揭示Piezo通道的機械門控機制，并提出了系列模型假說，譬如“杠杆模型”假說：胞内的長杆結構可作為杠杆撬開孔道[22, 29]。此外，蛋白上各個結構域的潛在作用也被逐步揭示：槳葉可以作為機械力傳導模塊[30]；錨定區（anchor）後的連接（linker）作用很關鍵：内質網蛋白SERCA可通過它抑制Piezo[31]，而E-cadherin蛋白可通過它将Piezo和細胞骨架聯系在一起而增強Piezo功能[32]；帽子區可感知、傳導機械力，并且決定了Piezo通道從打開到失活過程的快慢[25, 30]；長杆區之後的“門塞”序列可通過“門塞和闩鎖”機制完成Piezo三個胞内側向通路的協調門控[33]。

期待有朝一日，我們能獲得Piezo通道從關閉到開放再到失活等全部狀态下的結構以及在細胞膜上的原位結構，能将上述各種學說囊括入一個“大統一”框架内。

圖7. 推測的Piezo通道響應機械力而開放的模型 Piezo通道的側面視角，為便于查看，Piezo三聚體簡化為兩個亞基。紅色虛線箭頭和實線箭頭分别代表離子不通透和通透的狀态。（圖片改編自Jiang, et al., 2021, Trends Biochem Sci [34]）

（未完待續）

參考文獻

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作者介紹

劉文豪，清華大學生命學院2016級PTN項目博士生，師從肖百位教授。博士期間主要從事機械門控Piezo通道結構功能關系的研究，曾以共同第一作者在Nature、Neuron發表文章揭示Piezo通道機械門控過程的“雙門控”機制和“門塞和闩鎖”機制。