連續兩次求賢令：曾經我給你帶來了十萬用戶，但現在祝你倒閉，以及生信技能樹知識整理實習生招募，讓我走大運結識了幾位優秀小夥伴！大家開始根據我的ngs組學視頻進行一系列公共數據集分析實戰，其中幾個小夥伴讓我非常驚喜，不需要怎麼溝通和指導，就默默的完成了一個實戰！

他前面的分享是：

• Counts FPKM RPKM TPM CPM 的轉化

• 獲取基因有效長度的N種方

下面是他對我們b站轉錄組視頻課程的詳細筆記

前言：

進行RNA-seq入門實戰首先需要有一定的linux與R基礎，推薦跟着B站生信技能樹-jimmy老師學習打牢基礎：
【生信技能樹】生信人應該這樣學linux(更新至第14集)_哔哩哔哩_bilibili

【生信技能樹】生信人應該這樣學R語言_哔哩哔哩_bilibili

本節概覽：

1. Linux下RNA-seq環境創建:
   Ubuntu子系統下載安裝、Mniconda3與上遊分析軟件下載

2. R下RNA-seq環境創建
   R與Rstudio下載安裝、Bioconductor與R包下載

1. Linux環境設置

1.1 Linux系統的創建——Ubuntu

運行Linux系統一般使用服務器或者個人電腦的虛拟機（Virtualbox、VMware）和子系統，下面簡單介紹Windows子系統的安裝配置，詳細說明請參閱Windows子系統WSL的體驗與配置——Ubuntu-22.04

• Ubuntu子系統的下載安裝
  首先在win10中搜索“ 啟用或關閉Windows功能 ”，進入該程序，勾選“适用于Linux的Windows子系統”；之後去微軟商店搜索Ubuntu下載安裝，一般安裝默認版本或者最新的22.04LTS

• 用戶權限設置
  設置好用戶名和密碼進入Ubuntu後，需要設置一下用戶權限
  啟用root需要設置密碼：sudo passwd root
  添加用戶至root組：usermod -aG sudo username
  切換root用戶：su
  退出root：exit

• 軟件鏡像源設置
  一般選擇國内的清華鏡像，ubuntu | 鏡像站使用幫助 | 清華大學開源軟件鏡像站 | Tsinghua Open Source Mirror，Ubuntu 的軟件源配置文件是 /etc/apt/sources.list。将系統自帶的該文件做個備份，再編輯（* 注意要先切換為root用戶*才能編輯該文件）

su cd /etc/apt/ cp sources.list sources.list.bak vim sources.list

Ubuntu版本 22.04 LTS的設置（注意要找到對應的Ubuntu版本設置）如下：

# 默認注釋了源碼鏡像以提高 apt update 速度，如有需要可自行取消注釋 deb https:///ubuntu/ jammy main restricted universe multiverse # deb-src https:///ubuntu/ jammy main restricted universe multiverse deb https:///ubuntu/ jammy-updates main restricted universe multiverse # deb-src https:///ubuntu/ jammy-updates main restricted universe multiverse deb https:///ubuntu/ jammy-backports main restricted universe multiverse # deb-src https:///ubuntu/ jammy-backports main restricted universe multiverse deb https:///ubuntu/ jammy-security main restricted universe multiverse # deb-src https:///ubuntu/ jammy-security main restricted universe multiverse # 預發布軟件源，不建議啟用 # deb https:///ubuntu/ jammy-proposed main restricted universe multiverse # deb-src https:///ubuntu/ jammy-proposed main restricted universe multivers

• 更新一下所有軟件

sudo apt update #更新可用軟件包列表 sudo apt upgrade #更新已安裝的包

1.2 Mniconda3下載安裝

一般使用Mniconda3軟件進行創建分析環境和管理軟件，下面簡單介紹Mniconda3的安裝，其詳細使用說明請參閱Miniconda3的安裝、配置和使用

• 下載與安裝
  切換到安裝位置（一般為主目錄~）， 下載最新的miniconda3，bash啟動安裝，一直enter、yes就可以了。

wget https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh#wget -c https://repo.continuum.io/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh bash Miniconda-latest-Linux-x86_64.sh

• 設置conda軟件鏡像源
  依次輸入以下命令設置軟件鏡像源，并展示鏡像源地址，這裡設置了中科大鏡像：

conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/pro conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/r conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/free conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/pkgs/main conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda conda config --add channels https://mirrors.ustc.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge conda config --set show_channel_urls yes

• 創建分析環境
  創建rna流程環境rna_p3，指定python版本為3，同時下載sra-tools 軟件，之後每次要運行rna流程都要進入該環境

conda create -n rna_p3 python=3 sra-tools conda env list #查看環境conda activate rna_p3 #進入conda 環境 conda deactivate #退出當前conda環境

• 上遊分析軟件下載
  本次RNA-seq流程涉及軟件如下所示，使用conda install -y 軟件名=版本号依次進行下載即可，可同時下載多個軟件，但不建議同時下載太多，容易報錯

質控清洗：fastqc multiqc trim-galore
比對計數：hisat2 subread samtools=1.6 salmon

---

2. R環境設置

注意，安裝使用R首先需要你的電腦用戶名不能含有中文，否則後期運行程序會很容易報錯，如果用戶名含有中文請進行更改（很難。。。）或新建一個用戶；
Rstudio是R的編譯器，能提升用戶交互體驗，安裝Rstudio前一定要先安裝R

2.1 R與Rstudio下載安裝

• 先在清華鏡像源下載 R，地址：The Comprehensive R Archive Network (tsinghua.edu.cn)，
  依次進入：Download R for Windows——base——Previous releases；
  一般選擇下載R 4.1.3，使用最新版可能會有不适配的問題，使用默認選項一直确定安裝即可
  

• 安裝好 R後之後，再去Rstudio官網下載Rstudio，地址：Download the RStudio IDE - RStudio

• Rstudio中設置清華鏡像源
  依次進入：Tools——Global Options——Pakages——Change；選擇鏡像源
  

2.2 Bioconductor與R包下載

新建一個Rscript，運行以下内容，下載Bioconductor和本次實戰所需所有R包等，代碼修改自jimmy老師

###Bioconductor 下載 install.packages("BiocManager") 
###設置好清華鏡像rm(list = ls()) options()$repos options()$BioC_mirror #options(BioC_mirror="https://mirrors.ustc.edu.cn/bioc/") options(BioC_mirror="/bioconductor/") options("repos" = c(CRAN="https:///CRAN/")) options()$repos options()$BioC_mirror ###安裝需要的包BiocManager::install(c("GSEABase","GSVA","msigdbr","clusterProfiler" ),ask = F,update = F) BiocManager::install(c("GEOquery","limma","impute" ),ask = F,update = F) BiocManager::install(c("org.Hs.eg.db","org.Mm.eg.db"),ask = F,update = F) BiocManager::install(c("DESeq2","edgeR" ),ask = F,update = F) BiocManager::install("enrichplot",ask = F,update = F) BiocManager::install("devtools",ask = F,update = F) BiocManager::install("WGCNA",ask = F,update = F)  BiocManager::install("data.table",ask = F,update = F) BiocManager::install("tximport",ask = F,update = F) BiocManager::install("tidyverse",ask = F,update = F) BiocManager::install("DOSE",ask = F,update = F) BiocManager::install("patchwork",ask = F,update = F) BiocManager::install("RBGL",ask = F,update = F) #Vennerable依賴包BiocManager::install("pathview",ask = F,update = F) BiocManager::install(c("STRINGdb","ggraph","igraph"),ask = F,update = F) install.packages("Vennerable", repos="") #安裝Vennerable包 install.packages("statmod") #其他一些基礎包安裝 options()$repos install.packages(c("FactoMineR", "factoextra")) install.packages(c("ggplot2", "pheatmap","ggpubr","ggthemes", "ggstatsplot","ggsci","ggsignif")) install.packages("rvcheck") (.packages()) #查看當前加載運行包 
#更新所有包 rvcheck::update_all(check_R = F, which = c("CRAN", "BioC", "github"))

• 永久設置bioconductor鏡像

#bioconductor | 鏡像站使用幫助 | 清華大學開源軟件鏡像站 | Tsinghua Open Source Mirror file.edit('~/.Rprofile')

輸入以下内容：

# 清華源的鏡像 options(BioC_mirror="https:///bioconductor")

以上就是進行RNA-seq流程前的全部準備了，下一步就可以開始進行上遊數據下載、格式轉化和質控清洗等步驟啦

參考資料

GitHub - jmzeng1314/GEO （強烈推薦學習）

【生信技能樹】生信人應該這樣安裝軟件_哔哩哔哩_bilibili

【生信技能樹】生信分析入門環境搭建_哔哩哔哩_bilibili

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