分泌和攝取用于細胞間通訊的外泌體和其他胞外囊泡的特異性（上）

盡管人們在20世紀60年代後期首次描述了在哺乳動物組織或液體中，有囊泡在細胞周圍存在，但是直到2011年才提出通用術語“胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）”來定義所有的由脂質雙層包圍的胞外結構，如圖1所示。

在1980年代，人們描述了EV可以通過質膜向外出芽或通過細胞内内吞運輸途徑形成，其中這種途徑涉及多泡晚期内吞區室---也稱為多泡體（multivesicular body, MVB）---與質膜的融合，如圖2所述。

這種融合事件導緻這些區室中的管腔内囊泡（intraluminal vesicle, ILV）釋放到細胞外，從而産生一種稱為外泌體（exosome）的EV亞型，而且所産生的外泌體具有與ILV相同的大小（直徑<>

圖1.不同胞外囊泡（EV）亞型的物理特征。

人們最初認為外泌體分泌是細胞清除不想要的蛋白的一種機制。然而，20世紀90年代後期的研究表明，它可以起到細胞間通訊的作用，特别是在免疫反應和癌症中。

對這一概念的強烈支持出現在2007年，在那年科學家們已證實外泌體含有mRNA和microRNA，而且當被轉移到受者細胞（recipient cell）時，所含有的mRNA和microRNA仍然保持功能并改變細胞行為。

與此同時，EV被稱為微泡（microvesicle），微粒（microparticle）或核外粒體（ectosome），很可能是從質膜釋放出來的，而且也已經證實能夠在細胞之間轉移功能性的蛋白和RNA。

圖2.胞外囊泡（EV）分泌機制。

人們已觀察到在各種細胞類型中，大小與外泌體一樣或更大的EV是從細胞主體的質膜或膜延伸物（比如微絨毛、絲狀僞足，纖毛和鞭毛）出芽而形成的。大小與外泌體相當的EV在大小、密度和膜定位方面具有與外泌體相同的生物物理特征，因此，目前的方法無法有效地将它們區分開來。

細胞釋放出的源自MVB的外泌體與其他小型EV的相對比例是高度可變的，取決于細胞類型、環境條件和其他因素（比如感染或人工誘導分子表達），而且通過當前的大多數實驗方法制備出的外泌體可能含有内體起源的小型EV（也就是外泌體）和非内體起源的小型EV，以及其他的基于脂質的非囊泡結構（比如多種密度的脂蛋白，即中密度脂蛋白、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白）和新鑒定出的外泌顆粒（exomere）。

近期，富含晚期内體組分的外泌體被定義為一種帶有四跨膜蛋白CD63（一種在MVB中堆積的蛋白）和CD9/CD81（主要存在于質膜上）的小型EV亞型，不過這種定義還需在其他的細胞中和在其他的條件下進行驗證。

在包括癌症、免疫反應、心血管疾病、再生和幹細胞療法在内的許多病理生理情況下，EV發揮着許多功能。

盡管許多研究将這些功能描述為是外泌體特有的，但是人們已發現許多外泌體制備物存在潛在的多種亞細胞起源，這表明多種EV類型具有更廣泛的功能相關性。

在一篇新的發表在2019年1月那期Nature Cell Biology期刊上的評論類型文章中，Mathilde Mathieu等人通過一些非詳盡的例子讨論了外泌體和源自質膜的EV在生物發生、分泌、将它們的内含物靶向運送到受者細胞中和随後在受者細胞中發揮的功能方面的特異性[1]。

在MVB内部或質膜上的囊泡出芽

内體ILV和源自質膜的EV共有的一個重要特征是與在不同區室之間進行運送所需的其他細胞内出芽事件不同的是，它們都朝着遠離細胞質的方向進行出芽。

因此，它們的膜定位與細胞表面的膜定位相同，從而暴露跨膜蛋白的胞外結構域并包圍細胞質組分。

鑒于已知的EV生物發生、分泌以及與靶細胞之間相互作用的分子機制已在其他地方進行了全面綜述[2]，在這篇新的評論類型文章中，Mathilde Mathieu等人描述了囊泡（即未來的外泌體）在MVB内部形成的關鍵實例，以及這些機制是否以及如何适用于在質膜上形成的EV（圖2）。

（1） ESCRT。

轉運所需的内體分選複合物（ESCRT）是一個蛋白家族，它們在MVB膜上與一系列複合物（ESCRT-0，ESCRT-I，ESCRT-II和ESCRT-III）結合以便調節分子貨物靶向運送到ILV中和ILV形成。

在小型EV制備物中存在的TSG101（tumour susceptibility gene 101 protein）和其他的ESCRT蛋白或ESCRT輔助分子，比如ALIX（由PDCD6IP編碼）和VPS4（vacuolar protein sorting-associated protein 4），經常被視為它們起源自MVB的證據。

然而，ESCRT因子參與質膜上的各種出芽和膜斷裂事件，所有這些事件都需要ESCRT-I/II/III和輔助分子，這樣才能導緻EV釋放。

ESCRT-0組分通常未在質膜出芽和釋放模型中描述過。因此，EV分泌的ESCRT-0依賴性可能是一種證實它們起源自MVB的手段。因此，剔除HeLa細胞中的ESCRT-0組分HRS（由HGS編碼）或STAM1（signal transducing adapter molecule 1）會減少攜帶CD63和MHC-II/CD81的小型EV（對應于外泌體）的分泌。

然而，這些方法可能會引起不相關的但容易混淆在一起的影響。比如，在HIV病毒感染期間的HRS剔除通過阻止通常在質膜上截留病毒顆粒的tetherin（由BST2編碼）降解而減少了從質膜上釋放的病毒。

鑒于tetherin也将源自MVB的外泌體保留在質膜片（plasma membrane patch）上，這可能還減少了外泌體和源自質膜的EV的分泌。HRS結合到蛋白的泛素部分上，從而将蛋白靶向運送到ILV中。

然而，在小型EV中存在的泛素化蛋白并不能支持它們的外泌體性質，這是因為人們尚未證實質膜來源的EV缺乏泛素化蛋白。

相反，在細胞接觸1型幹擾素後，蛋白随後與泛素樣分子ISG15的結合經證實觸發MVB-溶酶體融合，從而減少外泌體分泌。

然而，鑒于ISG15的一個至為重要的靶标是TSG101，而TSG101也是質膜來源的小型EV形成所必需的，因此在增強的ISG15結合後觀察到的分泌體減少可能并不是外泌體所獨有的。

（2） 脂質。

朝着遠離細胞質的方向進行出芽的囊泡含有由鞘磷脂酶産生的錐形脂質，如神經酰胺。經證實抑制中性鞘磷脂酶（nSMAse-2，由SMPD3編碼）通過一種不依賴于ESCRT的機制阻止MVB中的ILV出芽和外泌體釋放。

雖然這篇新的文章并未探究它們對其他EV的影響，但是神經酰胺抑制藥物（尤其是GW4869）或靶向nSMAse-2的RNA幹擾通常用于證實所分析的EV的外泌體性質，和/或一種特定功能依賴于外泌體的性質。

然而，影響神經酰胺産生途徑會影響許多其他的細胞特性。具體而言，GW4869可通過一種不依賴于nSMAse的機制誘導稍大一些的質膜來源的EV的補償性分泌或細胞死亡。

此外，nSMAse控制着通用的後高爾基體轉運（post-Golgi trafficking），因而潛在地控制着所有分泌。神經酰胺還調節可能間接影響MVB穩态的自噬。

一般而言，在解釋化合物或對基因表達進行調節對EV分泌的影響時，應考慮對細胞死亡和自噬的影響。

在秀麗隐杆線蟲中，磷脂酰乙醇胺的外部化導緻EV出芽和釋放，其中磷脂酰乙醇胺通常通過翻轉酶（flippase）維持在質膜的胞質面上。

在哺乳動物細胞中，磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺不對稱性的喪失也導緻質膜來源的囊泡出芽，并且兩個具有促翻轉酶（scramblase）活性的蛋白家族參與這個過程。然而，這些機制對外泌體分泌的影響尚未被探究過。

（3） 多配體聚糖（syndecan）和多配體聚糖結合蛋白（syntenin）。

将跨膜蛋白特異性地靶向運送到MVB的ILV中也能夠通過蛋白-蛋白相互作用發生。

多配體聚糖結合蛋白-1（syntenin-1，由SDCBP編碼）在與多配體聚糖-1（syndecan-1）的胞質結構域結合後，招募ALIX，接着與ESCRT-I-III組分一起，允許向内出芽進入ILV中以及随後在含有外泌體的沉澱中回收多配體聚糖結合蛋白和多配體聚糖-1。

這種機制依賴于Src介導的多配體聚糖-1内吞作用，并且需要磷脂酶D2和ARF6（ADP-ribosylation factor 6, ADP-核糖基化因子6）的GTP酶活性。

然而，該途徑可能不是所有細胞類型中MVB來源的外泌體特有的。在樹突細胞和脂肪細胞中，多配體聚糖結合蛋白在小型EV（特别是對應于外泌體的那些EV）中最為豐富，但是也在較大的EV中檢測到。

此外，ARF6也是腫瘤細胞釋放較大的EV所必需的。

（4） MVB酸化。

沿着内吞途徑的逐步酸化是内化組分的降解和再循環所必需的。

Atg5（Autophagy protein 5, 自噬蛋白5）和Atg16L1将V1-ATP酶的E1亞基（由ATP6V1E1編碼）解離并因此清除它的質子轉運蛋白活性，或者巴弗洛黴素（bafilomycin）處理，均可降低MVB酸化并增加人細胞中的外泌體分泌。

這表明pH值可能是MVB作為分泌區室（secretory compartment）還是降解區室（degradatory compartment）的決定因素。

或者，增加的外泌體分泌可能是由于内吞作用減少和由MVB功能發生改變的細胞分泌的外泌體發生降解，或者是由于巴弗洛黴素對高爾基體運輸的間接影響。

雖然當前關于外泌體MVB中的生物發生的讨論并不詳盡，但是需要考慮的一個關鍵點是在目前已知的生物發生機制中，沒有一種機制是完全是外泌體途徑特有的，或者在所有細胞類型中都是有效的。

外泌體和EV分泌的胞内轉運

隻要允許MVB轉運至質膜并與質膜融合的細胞内轉運分子是外泌體分泌所特有的，那麼它們也可允許區分外泌體與質膜來源的EV。

（1） Rab GTP酶。

Rab家族的小GTP酶成員在胞内區室之間轉移囊泡方面發揮了良好的作用，并且還涉及MVB轉運到質膜上以便釋放外泌體。

比如，破壞Rab27a或Rab27b會改變MVB形态并及其在質膜上的停靠，這表明它們在外泌體分泌中發揮作用。雖然多項研究均未評估操縱Rab27a/b對其他EV分泌的影響，但是單獨抑制Rab27a會以一種依賴于MVB的方式降低HIV從質膜中分泌出來。

這一觀察結果是否也适用于非病毒誘導的質膜來源的EV仍然是不清楚的，但是在理解Rab27抑制的EV相關影響時，這一點是值得考慮的。

除了MVB之外，Rab27a/b參與Weibel-Palade 小體和高爾基體來源的分泌顆粒的分泌。因此，正如在剔除Rab27a的腫瘤細胞中對一些可溶性非EV相關蛋白所觀察到的那樣，Rab27a/b抑制可能影響存在于這些顆粒内的可溶性組分的分泌。

基于此，利用Rab27a/b抑制來證實外泌體或小型EV參與其中需要額外的步驟，比如通過外源性的外泌體或小型EV拯救表型。

同樣的考慮适用于促進外泌體或小型EV分泌的其他小GTP酶。比如，抑制Rab11a、Rab35或Rab7導緻小型EV恢複減少。

然而，Rab11和Rab35在早期内體或再循環内體中起作用，從而提高了釋放的囊泡來自早期内體或甚至來自質膜的可能性。

有趣的是，在細胞毒性T細胞中，Rab27a+晚期内體與Rab11a+再循環内體之間的融合由Rab27a效應物Munc13-4（由UNC13D編碼）介導，并且是調節細胞毒性顆粒與質膜之間的融合所必需的。

類似地，Rab11a和Rab27a交談可能參與最近描述的在人癌細胞系中發生鈣離子誘導的Rab11a-Munc13-4依賴性的外泌體分泌。

總之，這些研究表明細胞類型、環境和對處于穩定狀态或誘導時的EV分泌進行的分析（比如，通過鈣離子水平增加或其他方式）可能影響小型EV和/或外泌體分泌的機制，因此一種具體的實驗條件可能并不适用于其他的實驗系統。

（2） SNARE。

Rab GTP酶可能在比較早的或複雜的細胞内轉運步驟中起作用，從而用于調節外泌體分泌。

因此，研究外泌體生物發生的一個主要目的是鑒定MVB與質膜融合所特别需要的SNARE複合物。人們已發現YKT6 SNARE是攜帶Wnt的外泌體分泌所必需的，并且據報道Syx-5（秀麗隐杆線蟲中的一種與syntaxin-5存在同源關系的蛋白）通過Ral-1小GTP酶将MVB靶向質膜。

然而，鑒于這兩種SNARE都涉及内質網-高爾基體轉運，對它們的抑制也必然會影響正常的分泌途徑。

特别地，科學家們已發現作為一種神經元特異性的參與突觸小泡分泌的SNARE，syntaxin-1A影響果蠅中的外泌體分泌。

在HeLa細胞中，在組胺處理後，作為一種質膜相關的SNARE，SNAP-23（synaptosomal-associated protein 23, 突觸體相關蛋白23）自發地介導MVB-質膜融合。盡管這些SNARE參與更靠近質膜的融合事件因而可能不會幹擾上遊轉運，但是它們也可能參與分泌顆粒的分泌。

在細胞水平上可視化觀察MVB運輸和EV釋放也可區分分泌途徑和降解途徑。

比如，聯合使用pH敏感性的熒光CD63構建體和光電關聯顯微鏡（correlative light-electron microscopy），允許對MVB與質膜之間的融合進行明确的可視化觀察和定量分析。然而，該途徑與直接質膜出芽或與較弱酸性的區室之間的融合作出的相應貢獻是無法确定的，這是因為後面的事件不能通過這種類型的pH敏感性的實驗系統來加以量化。

（3）細胞骨架。

EV的出芽和釋放需要質膜下的肌動蛋白聚合發生變化以及随後在由小GTP酶RhoA精心協調的過程中發生肌動球蛋白細胞骨架收縮。

然而，人們尚未探究MVB周圍的肌動蛋白池（actin pool）的狀态及其對ILV形成的潛在影響。皮質肌動蛋白的解聚也可能是允許MVB停靠在質膜上以便外泌體在随後釋放所必要的。

因此，靶向肌動蛋白聚合可間接地促進外泌體分泌。類似地，這種微管網絡很可能是将MVB轉運到質膜上所必需的；然而，盡管對它進行藥物抑制會降低外泌體分泌，但是它也影響其他的質膜來源的結構域，比如纖毛或納米管。

因此，盡管細胞骨架成分可能在是分泌外泌體還是分泌質膜來源的EV中起重要作用，但是靶向它們也可能誘導多種非特異性的作用。

包膜病毒與外泌體和其他的小型EV相比較

包膜病毒出芽與小型EV的生物發生有許多相似之處。

病毒在病毒顆粒組裝和出芽的不同步驟中使用宿主細胞内的運輸機制，而對EV而言，這些步驟可能根據病毒和宿主細胞的不同在不同位置發生。

在HIV-1中，病毒組裝發生在T細胞的質膜上，而在巨噬細胞中，它發生在内部區室中。在膜出芽部位招募HIV-1 Gag蛋白對于病毒組分的最終組裝是必需的。Gag還會招募ESCRT複合物，包括TSG101和ALIX，它們最終通過膜裂變事件介導新生顆粒的釋放。

Gag的核衣殼結構域能夠模拟多配體聚糖結合蛋白的PDZ結構域來捕獲ALIX，這就使得多配體聚糖結合蛋白能夠在HIV-1出芽期間替代核衣殼功能。

與較大的EV和含有多配體聚糖結合蛋白的外泌體相比，HIV-1出芽并不依賴于ARF6 GTP酶，但它還涉及許多已知也促進EV分泌的Rab蛋白，包括Rab9、Rab7a、Rab27a、Rab14和Rab11-FIP1C。

Rab14是個例外，它在EV調節中的潛在作用仍有待研究。SNARE也參與HIV和EV釋放。對SNARE機制的抑制證實它在Gag蛋白定位到質膜上發揮作用，因此，也在HIV-1裝配中發揮作用。

然而，尚未确定的是一些SNARE是否是EV特有的而不會影響HIV顆粒。

最後，HIV-1組裝涉及絲狀肌動蛋白結構的形成，這種結構會在病毒出芽後消失。雖然幹擾肌動蛋白的藥物會減少病毒産生，但是如前所述，它們也可能影響EV的釋放。由于這些過程的許多方面仍然在很大程度上是未知的，因此有必要鑒定和描述調節EV和病毒産生的特定步驟的各個分子。

HIV-1病毒的直徑大約為120nm，與外泌體和小型EV的直徑相當。這些膜包圍結構還具有其他的物理和分子特征。

比如，HIV-1病毒顆粒和小型EV的脂質組合物包括高比例的膽固醇、鞘磷脂和飽和脂質，并且它們都具有相同的膜定位。HIV-1病毒顆粒膜也富含CD63和CD81四跨膜蛋白，其中這兩種四跨膜蛋白存在于小型EV上。

這些相似性使得在受到病毒感染的細胞中将病毒顆粒和EV分離開來特别具有挑戰性。比如，小型EV和HIV-1病毒顆粒在蔗糖密度梯度中達到相同的平衡密度。

更為複雜的是，受到病毒感染的細胞産生經過修飾的整合着病毒基因組片段和病毒蛋白的EV，這意味着經典的純化技術導緻這些組分共純化。

因此，在HIV-1感染期間對小型EV功能的研究受到難以獲得不含HIV的EV制備物的阻礙，這可能解釋在誘導前病毒EV反應和抗病毒EV反應方面存在相互矛盾的報道。

參考文獻：

1. Mathilde Mathieu et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology, January 2019, 21(1):9–17, doi:10.1038/s41556-018-0250-9.

2. Van Niel et al. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2018, 19, 213–228.

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