1、什麼是基因編輯

基因編輯是一種新興的能夠較為精确的對生物體基因組特定目标基因進行修飾的基因工程技術。基因編輯工具是一個由序列特異性的DNA結合結構域和非特異性的DNA修飾結構域組合而成的序列特異性核酸内切酶，基因編輯的過程可以概括為一找、二剪、三修補，識别染色體上的DNA靶位點（找），進行切割并産生DNA雙鍊斷裂（剪），誘導DNA的損傷修複（修補），從而實現對指定基因組的定向編輯。簡單來說，基因編輯就是利用一個經過改造的蛋白作為工具，對指定的基因進行定向改造。

第一代基因編輯技術—ZFNs技術

ZFNs（鋅指核酸酶）技術是第一代基因組編輯技術，其功能的實現是基于具有獨特的DNA序列識别的鋅指蛋白（ZFP）發展起來的。ZFNs由特異性識别序列的鋅指蛋白(ZFP)和FokI核酸内切酶組成。其中，由ZFP構成的DNA識别域能識别DNA的特異位點并與之結合，而由FokI構成的切割域能執行剪切功能，兩者結合可使靶位點的雙鍊DNA斷裂(DSB)。于是，細胞可以通過同源重組(HR)修複機制和非同源末端連接(NHEJ)修複機制來修複DNA。HR修複有可能會對靶标位點進行恢複修飾或者插入修飾，而NHEJ修複極易發生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達到基因敲除的目的。

圖：ZFNs作用原理（資料來源：根據公開資料整理）

第二代基因編輯技術—TALENs技術

TALENs（轉錄激活因子效應物）是繼ZFNs之後的另一種較為靈活和高效的靶向編輯技術，TALENs在結構上與ZFNs類似，是由特異性的DNA結合蛋白-TALE蛋白和FokⅠ核酸酶兩部分組成。TALE蛋白是植物病原體-黃單胞菌分泌的一種轉錄激活因子效應物，是一類分泌蛋白，在植物細胞中能夠特異性地識别并結合寄主靶基因的序列，從而調控寄主的基因表達。進行基因編輯時，兩個TALE蛋白識别和結合DNA靶位點，FokⅠ核酸酶負責對靶DNA進行切割，從而造成DNA的DSBs，誘發細胞的DNA損傷修複機制，從而實現對基因組靶位點的編輯。

TALENs的合成與組裝相對于ZFNs要簡單和靈活，其關鍵是要合成TALE蛋白串聯重複區的編碼DNA序列，理論上将多個TALE重複單元編碼的DNA序列通過多次連接即可實現，但是要合成這種高度重複序列也具有一定的困難和挑戰。目前，已經開發出多種快速、簡便合成和組裝TALENs方法，如Golden gate (GG)組裝法、快速高通量固相合成法等。

圖：TALENs作用原理（資料來源：根據公開資料整理）

第三代基因編輯技術—CRISPR-Cas技術

CRISPR-Cas技術是基于原核生物(細菌和古生菌)一種免疫系統而開發的，稱之為Clustered regularly interspaced short palindro- mic repeats-CRISPR-associated proteins (規律成簇間隔短回文重複及其相關蛋白)，簡稱CRISPR-Cas系統。由于該技術合成簡單、周期短、操作靈活、效率高等優點，目前備受人們關注。CRISPR-Cas工作原理如下1. sgRNA與Cas蛋白結合，形成核糖核蛋白（RNP）複合物2. RNP複合物在sgRNA的引導下，定位到基因組上的靶位點。3. Cas蛋白會識别原間隔基序(protospacer adjacent motif，簡稱 PAM)，對靶位點的DNA雙鍊進行切割，産生雙鍊斷裂（DSB）。4. DSB引起細胞的緊急修複機制：非同源末端連接（NHEJ）修複或者同源重組修複（HDR）5. 絕大多數情況下（>80%），細胞采用NHEJ修複路徑，使得靶位點位置随機産生個别堿基的删除或插入（Indel），得到基因敲除模型。6. 極少數情況下（<20%），且細胞内存在同源片段時，細胞采用HDR修複路徑，使得靶位點産生精确修複。7. 在同源片段中引入外源基因片段或者突變堿基，可得到基因定點插入模型或者基因定點突變模型

圖：CRISPR/Cas9作用原理（資料來源：根據公開資料整理）

三種基因編輯技術的比較

作為革命性的基因編輯技術，CRISPR/Cas的優勢非常明顯，相較于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas的設計難度和構建難度都要小的多，成本更低，開發周期更短，靶向修飾效率更高，此外CRISPR/Cas還具有可以多靶點編輯和可以編輯RNA的優勢，這是前兩種技術所不具備的。但是CRISPR/Cas有一個明顯的缺點，如果靶基因附近沒有PAM則無法實現對靶基因的編輯。ZFNs技術作為開發時間最久的基因編輯技術，已經積累了大量臨床試驗數據，在應用于藥物研發方面更為成熟。

圖：三種基因編輯技術比較（資料來源：根據公開資料整理）

2、基因編輯技術的應用亮點

治療遺傳病的技術和成本優勢

治療遺傳病的藥物有很多種類，其中最為重要的一種就是基于AAV載體的遺傳病治療藥物，但是這類藥物有兩個缺點，一是售價高，二是AAV載體包裝能力有限，如前文所述， Spark公司的AAV基因療法，通過腺相關病毒AAV，将正确的RPE65基因遞送到視網膜細胞，從而治療Leber先天性黑蒙2型，該療法是FDA批準的首個基因療法，售價高達85萬美元/年。然而，這一方法卻對Leber先天性黑蒙10型（LCA10）無能為力，因為CEP290基因的編碼序列長達7.5kb，遠超AAV病毒的包裝能力極限（4.7kb）。而基因編輯藥物可以編輯更長的基因序列，成本也要低得多。

提高CAR-T細胞的制備效率和功能

CAR-T細胞療法通過采集患者身體内的T細胞，然後經過攜帶CAR基因的病毒改造後回輸到人的體内，達到治療癌症的目的，原始的制備方法用時長、難度高、成本大，還有可能會引起人的自身免疫反應。基因編輯可以顯著提高CAR-T細胞的制備能力和效率。我國科學家王皓毅研究組2016年利用CRIPSR/Cas9技術對CAR-T細胞進行了TRAC、B2M雙基因敲除和TRAC、B2M和PD-1的三基因敲除，大大降低了自身免疫原性顯著提高了CAR-T抗腫瘤活性；2017年國外課題組同樣利用CRISPR/Cas9技術敲除TCR和HLA-I相關基因，敲除後的CAR-T未觀察到GVHD；此外，在臨床上也有報道接受UCAR-T治療成功的案例。

為治愈HIV帶來曙光

2019年，美國坦普爾大學和内布拉斯加大學醫學中心的研究團隊稱，他們能夠使用CRISPR/Cas技術在人源化小鼠身上摧毀HIV，這是人類首次證明HIV是可以被治愈的。

同年，中國科學家對人類幹細胞進行體外基因編輯，使其天然能夠抵禦HIV，并将其移植到一名罹患血液系統腫瘤的HIV感染者身上。經基因編輯的細胞在患者體内持續存活了一年多且未引起明顯副作用，但細胞數量較少，不足以降低血液中HIV的病毒載量。

應用于診斷試劑的低成、本高效率等優勢

2020年12月由杭州衆測生物研發的新型冠狀病毒 2019-nCov 核酸檢測試劑盒（CRISPR 免疫層析法）獲批，是國内首次批準利用 CRISPR 技術的新冠病毒檢測試劑盒。

在IVD領域CRISPR技術相較于PCR技術有諸多優勢：CRISPR診斷特異性極好，可以檢測到一個堿基的突變，非常适合早期篩查腫瘤、檢測腫瘤易感基因和緻病基因。同時，CRISPR診斷技術操作簡單、對儀器設備依賴性低、價格低廉，适合野外檢測和不發達地區檢測；例如國内某獸醫科研單位基于CRISPR建立适合養殖場淨化的診斷方法，剛果民主共和國利用CRISPR分子診斷技術檢測埃博拉病毒。另外，CRISPR診斷對操作者的要求低、結果可視化，因此家庭用CRISPR診斷試劑盒也是許多公司發展的方向。

圖：CRISPR分子診斷技術和PCR技術比較（資料來源：根據公開資料整理）

構建新型模式動物

以前通過基因編輯的方法構建靈長類動物疾病模型幾乎是不可能的事，而靈長類動物疾病模型對于醫藥研發非常重要。CRISPR/Cas技術誕生後，人們可以輕易的實現靈長類動物的基因編輯，從而構建出各種各樣的疾病模型。

3、基因編輯的技術發展趨勢

ZFNs和TALENs不斷降低成本，縮短開發周期

相較于CRISPR，ZFNs和TALENs明顯的缺點是構建複雜，開發周期長，成本高，未來彌補這方面的缺陷是這兩種技術未來發展的主要趨勢。ZFNs的領導者Sangamo表示，在過去，ZFNs的開發周期可能長達三個月，而确定最終治療ZFNs通常耗時一年。經過改進後，開發周期已經縮短到10天，在此期間，細胞中的構建體被設計、組裝和測試，最終生産治療ZFN所需的總時間已經縮短至3個月。

CRISPR 基因編輯不受PAM限制，實現任意基因組位點編輯

CRISPR-Cas9有一個明顯的短闆，不能對不在 PAM 序列附近的基因進行編輯。為了克服這個障礙，由 MGH 基因組醫學中心的生物化學家Benjamin P. Kleinstiver領導的研究小組，設計了一種 Cas9蛋白的變種，它不需要特定的 PAM 來結合和切割 DNA。這兩種新的Cas9變種，分别命名為 SpG和SpRY，允許編輯 DNA 序列，其效率是傳統的CRISPR-Cas9酶無法達到的。

克服脫靶率

ZFNs和CRISPR/Cas都會面臨脫靶率高的問題。2016年，Sangamo 在Nature Communications上發表了一篇論文，他們開發了一個系統，可以選擇以高比率在正确的位置切割基因的ZFNs，即使在非常高的靶向活性下，仍然保證脫靶率降至檢測限水平或者更低。CRISPR/Cas脫靶率的高低關鍵在于gRNA的設計，gRNA和非目标區域過多的非特異性結果，脫靶效率較高，特别是靠近PAM的8-10bp不能和非目的區有高同源性。目前為了提高基因組編輯的準确性，對Cas9核酸酶進行了突變，突變後的Cas隻能切割DNA雙鍊中的一條鍊，通過兩個gRNA引導Cas對DNA切割，可以顯著提高基因組編輯的特異性，降低脫靶率。

來源：中關村産業研究院