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文獻解讀|胃癌ceRNA的功能機制研究

競争性内源RNA(competingendogenous RNA,ceRNA)是指編碼RNA及非編碼RNA相互作用的複雜網絡系統,目前ceRNA在人疾病中的研究十分火熱,對于研究非編碼RNA無疑是一種捷徑,但是由于ceRNA的預測相對已經比較簡單,想要發表較高分的雜志,後期機制研究必須足夠嚴謹和充分,下面解讀的這篇文獻在研究思路和實驗方法上,可以說是一篇完整的研究ceRNA功能的文章。

研究背景

胃癌(GC)是最常見的癌症之一,其中轉移成為GC臨床實踐中一個重大的挑戰,是GC死亡和複發的主要原因。目前已有很多關于轉移的分子機制研究,但mRNA和非編碼RNA(ncRNAs)之間潛在調控網絡的作用還未被完全闡明。

研究方法

6對胃癌組織和癌旁組織進行mRNAs、miRNAs和lncRNAs microarray分析。

研究結果

1

CLDN4是miR-596和miR-3620-3p的靶标

為了确定GC中mRNA和ncRNAs的調控網絡,使用microarray 分析6對胃癌組織和癌旁組織中差異表達的mRNAs、miRNAs和lncRNAs。結果發現,235種miRNAs,4329種lncRNAs,以及3369種mRNAs在兩種組織中差異表達。然後将microarray分析結果與差異表達的miRNAs的預測靶标取交集。

根據差異表達mRNAspathway富集分析結果及miRNAs和lncRNAsmicroarray分析結果,選擇與癌症發展有關的經典通路中的經典基因進行ceRNA分析。

結果表明,Tight junction信号通路中, CLDN4和癌症發生密切相關。進而對CLDN4及相關的miRNA進行驗證,表明miR-596和miR-3620-3p直接靶定CLDN4,負調控CLDN4的表達。

圖1 GC中mRNA-lncRNA -miRNA調控網絡

2

CLDN4體外生物學功能

為了驗證CLDN4的生物學功能以及與miR-596和miR-3620-3p的關系,在三種胃癌細胞系中,SGC-7901、AGS和HGC-27,過表達CLDN4。

結果表明,過表達CLDN4顯著上調GC細胞的增殖和侵襲能力,同時過表達miR-596或miR-3620-3p時可以消除這種影響。反之,在GC細胞系中敲降CLDN4時,細胞的增殖和侵襲能力受到抑制,同時抑制miR-596或miR-3620-3p的表達則恢複大部分影響。

同時,作者注意到過表達CLDN4誘導GC細胞出現間充質樣形态特征,随後對CLDN4與EMT相關基因的相關性進行研究。結果顯示,相較于pEX2-NC細胞系,在GC細胞系中過表達CLDN4能夠誘導EMT。綜合這些結果發現,CLDN4促進細胞增殖、侵襲以及EMT,同時miR-596和miR-3620-3p可消除部分影響。

圖2CLDN4促進GC細胞增殖和侵襲

3

CLDN4和miRNAs在GC組織中的表達情況

對104對GC組織和癌旁組織中的CLDN4表達水平進行分析,結果顯示,76.92%的患者在癌組織中顯示更高的CLDN4表達水平,并且較高的CLDN4表達水平與總體存活率顯著相關。多因素Cox分析結果顯示較高的CLDN4表達是GC不良預後的獨立預測因子。

同時,miR-596和miR-3620-3p在GC組織中表達水平顯著降低。20例GC組織原位雜交結果顯示,CLDN4、miR-596和miR-3620-3p主要在上皮和癌細胞中表達,主要定位于胞漿。

4

lncRNAs通過直接結合與miRNAs相互作用

研究發現,在“Tightjunction”網絡中的14個候選lncRNA中,lncRNA-KRTAP5-AS1在過表達miR-596後下調最顯著,過表達miR-3620-3p後,lncRNA-TUBB2A和lncRNA-KRTAP5-AS1表達降低程度最明顯,并且過表達lncRNA-KRTAP5-AS1或lncRNA-TUBB2A上調CLDN4的表達。

構建GFP-MS2-lncRNA融合表達載體,利用GFP蛋白進行pull down,并對下拉産物進行檢測,結果顯示,lncRNA-KRTAP5-AS1RIP的産物顯著富集miR-596和miR-3620-3p,同樣,lncRNA-TUBB2A RIP産物顯著富集miR-3620-3p。随後RNA pull down實驗為miRNAs和lncRNAs之間的相關性提供了更确切的證據,miR-596和miR-3620-3p可被生物素标記的lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A拉下。

這些證據揭示了lncRNA-KRTAP5-AS1可以結合miR-596和miR-3620-3p,lncRNA-TUBB2A可以結合miR-3620-3p。

圖3 lncRNAs通過直接結合與miRNAs相互作用

5

lncRNA作為ceRNA在體外調節細胞功能

基于Ago的RIP分析,可以通過免疫共沉澱富集到miRNA的結合靶标。在GC細胞系中分别過表達lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A,Ago抗體下拉的産物中,富集到的CLDN4轉錄産物顯著下降,存在較少的CLDN4與miRNA結合,表明lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A可以與CLDN4競争性結合miRNAs。

lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A作為ceRNA調節CLDN4的表達,促進GC細胞增殖、侵襲和EMT,lncRNA-KRTAP5-AS1充當miR-596和miR-3620-3p的ceRNA,lncRNA-TUBB2A充當miR-3620-3p的ceRNA。

圖4 LncRNA-KRTAP5-AS1和LncRNA-TUBB2A充當ceRNAs

6

ncRNAs在體内調控CLDN4的功能

通過皮下移植的腫瘤模型和腫瘤轉移模型檢測不同細胞克隆對體内增殖和轉移的影響,發現CLDN4促進體内增殖和轉移,其可以被miR-596和miR-3620-3p所抑制,但能被過表達lncRNA-KRTAP5-AS1和lncRNA-TUBB2A所增強。

小 結

1.通過構建胃癌ceRNA調控網絡,尋找與胃癌發展密切相關的經典mRNA及其ceRNA。

2.确定目标分子-ceRNA後,在體内體外對調控機制及功能進行驗證。

3.本文功能驗證部分實驗設計嚴謹且豐富,可以作為ceRNA後期驗證的參考。

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