【求助】組織TUNEL染色
産品名稱： 羅氏(Roche)公司Tunel試劑盒
英文名稱： Tunel
産品貨号： 11684817910
産品規格： 50T
試劑級别： 試劑級
産品産地： USA
産品商标： Roche
In situ cell death detection kit-POD法
一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）标記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結合，後者又與HRP底物二氨基聯苯胺（DAB）反應産生很強的顔色反應（呈深棕色），特異準确地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒适用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞塗片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法确定細胞死亡類型和分化階段。
二、 器材與試劑器材：光學顯微鏡及其成像系統、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素标記的dUTP 1×、标記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、 實驗步驟操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時間、濃度均需摸索）或者加細胞通透液8min；5. PBS漂洗2次；6. 制備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素标記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素标記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應在15~25℃×10min，後面步驟同處理組。7. 玻片幹後，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素标記的dUTP液）于标本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；10. 玻片幹後加50μl converter-POD于标本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。11. PBS漂洗3次；12. 在組織處加50~100μlDAB底物，反應15~25℃×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照後再用蘇木素或甲基綠複染，幾秒後立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照。可結合凋亡細胞形态特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體）對于培養細胞的預處理：①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4），幹燥後在去離子水中漂洗，幹燥後4℃保存；②适當方法誘導細胞凋亡，同時設未經誘導的對照組，各組離心收集約1×106個細胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然幹燥，使細胞很好的吸附到載玻片上；③将吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見備注5）中處理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；後續操作如同石蠟包埋切片的6—15
四、 注意事項1. 進行PBS 清洗時，每次清洗5 min。2. PBS清洗後，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS 溶液後再進行下一步反應。3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液後，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液幹燥造成實驗失敗。4. TUNEL反應液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。5. 如果20×DAB 溶液顔色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色後，請用滅菌蒸餾水清洗多餘的甲基綠。然後進行洗淨（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片後通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗淨時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。7. 熒光素标記的dUTP液含甲次*酸鹽和二氯钴等緻癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。8. 試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以後就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内穩定，避免再次凍存；TUNEL反應液臨用前配好後，放至冰上直至使用。9. 結果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可産生大量DN**斷，從而引起假陽性結果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞内反應，進而産生假陰性結果。
英文名稱： Tunel
産品貨号： 11684817910
産品規格： 50T
試劑級别： 試劑級
産品産地： USA
産品商标： Roche
In situ cell death detection kit-POD法
一、 原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細胞在凋亡早期過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）标記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結合，後者又與HRP底物二氨基聯苯胺（DAB）反應産生很強的顔色反應（呈深棕色），特異準确地定位正在凋亡的細胞，因而在光學顯微鏡下即可觀察凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3‘-OH形成，很少能夠被染色。本試劑盒适用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞塗片）在單細胞水平上的凋亡原位檢測。還可應用于抗腫瘤藥的藥效評價，以及通過雙色法确定細胞死亡類型和分化階段。
二、 器材與試劑器材：光學顯微鏡及其成像系統、小型染色缸、濕盒（塑料飯盒與紗布）、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的加樣器及槍頭等；試劑：試劑盒含TdT 10×、熒光素标記的dUTP 1×、标記熒光素抗體的HRP；自備試劑：PBS、雙蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（臨用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl， pH 7.4-8）或細胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，臨用前配制）、蘇木素或甲基綠、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、 實驗步驟操作流程圖：制作石蠟切片→脫蠟、水合→細胞通透→加TUNEL反應液→加converter-POD→與底物DAB反應顯色→光學顯微鏡計數并拍照。具體操作步驟（石蠟包埋切片的檢測）：1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；注：上面兩步是針對石蠟切片樣本的處理4. 用Proteinase K工作液處理組織15-30 min 在21–37°C（溫度、時間、濃度均需摸索）或者加細胞通透液8min；5. PBS漂洗2次；6. 制備TUNEL反應混合液，處理組用50μl TdT+450μl 熒光素标記的dUTP液混勻；而陰性對照組僅加50μl 熒光素标記的dUTP液，陽性對照組先加入100μl DNase 1，反應在15~25℃×10min，後面步驟同處理組。7. 玻片幹後，加50μl TUNEL反應混合液（陰性對照組僅加50μl 熒光素标記的dUTP液）于标本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×1h。8. PBS漂洗3次；9. 可以加1滴PBS在熒光顯微鏡下計數凋亡細胞（激發光波長為450~500nm，檢測波長為515~565nm）；10. 玻片幹後加50μl converter-POD于标本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37℃×30min。11. PBS漂洗3次；12. 在組織處加50~100μlDAB底物，反應15~25℃×10min；13. PBS漂洗3次；14. 拍照後再用蘇木素或甲基綠複染，幾秒後立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。15. 加一滴PBS或甘油在視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡細胞（共計200~500個細胞）并拍照。可結合凋亡細胞形态特征來綜合判斷（未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象，晚期出現凋亡小體，貼壁細胞出現鄒縮、變圓、脫落；而染色細胞呈現染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解，染色質分割成塊狀/凋亡小體）對于培養細胞的預處理：①在載玻片上鋪一層薄薄的多聚賴氨酸（見備注4），幹燥後在去離子水中漂洗，幹燥後4℃保存；②适當方法誘導細胞凋亡，同時設未經誘導的對照組，各組離心收集約1×106個細胞，PBS洗一次，重懸，加到鋪好的多聚賴氨酸載玻片上，自然幹燥，使細胞很好的吸附到載玻片上；③将吸附細胞的載玻片在4%多聚甲醛（見備注2）中固定25min；④PBS浸洗二次，每次5min；⑤将吸附細胞的載玻片在0.2%的Triton X-100（見備注5）中處理5min；⑥PBS浸洗二次，每次5min；後續操作如同石蠟包埋切片的6—15
四、 注意事項1. 進行PBS 清洗時，每次清洗5 min。2. PBS清洗後，為了各種反應的有效進行，請盡量除去PBS 溶液後再進行下一步反應。3. 在載玻片上的樣本上加上實驗用反應液後，請蓋上蓋玻片或保鮮膜，或在濕盒中進行，這樣可以使反應液均勻分布于樣本整體，又可以防止反應液幹燥造成實驗失敗。4. TUNEL反應液臨用前配制，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。5. 如果20×DAB 溶液顔色變深成為紫色，則不可使用，需重新配制。6. 用甲基綠（Methyl Green）染液（3-5%甲基綠溶于0.1M 醋酸巴比妥 PH4.0）染色後，請用滅菌蒸餾水清洗多餘的甲基綠。然後進行洗淨（100%乙醇）、脫水（二甲苯）透明、封片後通過光學顯微鏡觀察操作。如果此時使用80~90%的乙醇洗淨時，甲基綠比較容易脫色，注意快速進行脫水操作。7. 熒光素标記的dUTP液含甲次*酸鹽和二氯钴等緻癌物，可通過吸入、口服等途徑進入機體，注意防護。8. 試劑保存；未打開的試劑盒貯存在-20℃（-15~25℃）；converter -POD液一旦解凍，以後就保存在4℃（2~8℃）下，至少在6 m内穩定，避免再次凍存；TUNEL反應液臨用前配好後，放至冰上直至使用。9. 結果分析時注意：在壞死的晚期階段或在高度增殖/代謝的組織細胞中可産生大量DN**斷，從而引起假陽性結果；而有些類型的凋亡性細胞死亡缺乏DNA斷裂或DNA裂解不完全，以及細胞外的矩陣成分阻止TdT進入胞内反應，進而産生假陰性結果。
最新文章
-
各地狗肉制法
7分鐘前 -
最完整裝修篇，開工到入住整個過程講解及注意事項，要裝修的收了
21分鐘前 -
40歲必須悟透的20條人性道理
42分鐘前 -
WindowsWindows電腦如何給hosts添加解析
54分鐘前 -
教你把文字做成視頻，視頻剪輯，短視頻制作
1小時前 -
真正厲害的人，早把人生調成了“靜音模式”
1小時前 -
永吃不膩的幾道家常菜，好吃還不貴，大廚把秘方分享給大家
2小時前 -
為人處世的30條鐵律，沒人會教你
2小時前
熱門文章
-
威士忌高階關于 OB 與 IB，一次給你說透！
2天前 -
老張老李侃門球之140篇
4天前 -
美麗中國-2870：中國最大的内陸河，塔裡木河
4天前 -
這個穴位可以治療多種胃痛腹痛，還可以減肥
1周前 -
診餘雜記（師傳經驗）
6天前 -
門球技巧 隻需五個字讓你打好門球
4天前 -
二十四山開門放水作竈真訣開門放水作竈直訣——子山
4天前 -
龍樹造青目釋《中論》白話（二）
5天前
有話要說...