在這個風和日麗的日子,我們賽誠又來放幹貨了,今天我們繼續對ceRNA研究進行機制進行深度解讀,放出第三篇關于ceRNA機制的文獻”LncRNA作為miR-331-3p的海綿吸附體調控HER2的表達”鑒賞。
一、調控通路
當LncRNA HOTAIR低表達時,miR-331-3p與ago2結合到HER2 Mrna的3’-UTR抑制翻譯;當LncRNAHOTAIR高表達時,LncRNAHOTAIR競争性的結合miR-3313p-ago2,使HER2mRNA的翻譯不受抑制,從而促進了HER2蛋白的表達。
二、實驗流程
本文旨在說明LncRNA HOTAIR結合miR-331-3p後解除其對HER2mRNA翻譯的抑制從而促進HER2蛋白表達。作者首先根據臨床樣本進行Q-PCR檢測正常組織細胞核胃癌細胞的LncRNAHOTAIR的表達和存活率與LncRNAHOTAIR表達量關系的分析篩選出本文的主體LncRNAHOTAIR。再進行功能和作用機制兩方面的研究。
(1)功能實驗:通過建立LncRNAHOTAIR過表達/敲低穩定細胞株,分别進行MTT實驗、Hoechst染色、流式細胞儀、Transwell、動物體内成瘤實驗驗證LncRNAHOTAIR對細胞增殖,細胞凋亡的影響。(2)機制實驗:生物信息學分析表明LncRNAHOTAIR有與microRNA的結合位點,作者通過熒光素酶實驗驗證了LncRNAHOTAIR與miR-331-3p的結合,同樣的用熒光素酶實驗檢測HER23’-UTR與miR-331-3P的關系,然後用Ago2-RIP技術驗證了LncRNAHOTAIR與miR-331-3p-Ago2結合。最後通過使用WB檢測LncRNAHOTAIR過表達/敲低後的HER2蛋白的表達驗證了LncRNAHOTAIR對HER2的促進作用。
三、核心FIGURE
Figure1說明LncRNAHOTAIR以miR-331-3p為靶标來調控HER2的表達。
A、生物信息學預測LncRNA HOTAIR與microRNA的結合位點。
B、熒光素酶實驗,将連接LncRNA的熒光素酶報告質粒與microRNA轉染細胞,檢測熒光素酶活性,結果表明LncRNAHOTAIR與miR-331-3p的熒光素酶活性顯著降低,說明LncRNAHOTAIR與miR-331-3p高度結合。
C、熒光素酶實驗,将HER2 3’-utr連到熒光素酶報告質粒上,與LncRNAHOTAIR表達質粒共轉染,然後轉染miR-331-3p檢測熒光素酶活性。表明miR-331-3p抑制熒光素酶活性,HOTAIR促進熒光素酶活性。
D、Ago2-RIP,用Ago2蛋白抗體釣取與Ago2-結合的RNA,然後通過q-pcr檢測表明Ago2結合LncRNAHOTAIR和miR-331-3p。
E、通過WB檢測miR-331-3p過表、HOTAIR敲低和過表達細胞的HER2的表達,說明miR-331-3p抑制HER2表達,而HOTAIR促進HER2的表達。
本公司可提供的技術服務
本公司可進行以上類似實驗的實驗設計及整體實驗外包項目,包括q-pcr、WB、慢病毒穩轉株的建立(過表達/敲低)、luciferase Assay、Ago2-RIP,其中Ago2-RIP、luciferaseAssay為本公司主營項目。
一、luciferaseAssay:檢測microRNA與靶标基因3’-UTR的關系。
将HER23’-utr連到熒光素酶報告質粒上,與LncRNAHOTAIR表達質粒共轉染,然後轉染miR-331-3p檢測熒光素酶活性。表明miR-331-3p抑制熒光素酶活性,HOTAIR促進熒光素酶活性。也就是說HOTAIR解除了MiR-331-3p對蛋白表達的抑制。
二、Ago2-RIP:主要研究ago2蛋白與RNA的相互作用
用Ago2蛋白抗體釣取與Ago2結合的RNA,然後通過q-pcr檢測,結果表明Ago2結合LncRNAHOTAIR和miR-331-3p。我公司在實驗體系中設置陽性及陰性對照,進一步排除系統誤差。
參考文獻:Xiang-hua Liu, Ming Sun, Feng-qi Nie,et al. Lnc RNAHOTAIR functions as a competingendogenous RNA to regulate HER2 expressionbysponging mi R-331-3p in gastric cancer. Molecular Cancer,2014,13:92
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