功能性證據PS3/BS3 怎麼使用(ClinGen 2020年)

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2015年，美國醫學遺傳學與基因組學學會(The of and , ACMG)發布的序列變異解讀指南，對PS3 BS3 功能研究描述如下：

功能實驗研究是一種研究變異緻病性的非常強大的工具，然而并非所有的功能研究都能有效地預測基因或蛋白的功能。例如，一些酶學實驗利用成熟完善的方法可以用來評估錯義變異在代謝途徑中對酶活性的影響(如α-半乳糖苷酶功能實驗)；

而另一方面, 某些功能實驗在評估變異對蛋白質功能的影響時缺乏一緻性。評估一個功能檢測方法是否有效時，必須考慮該功能實驗在多大程度上反映了其發揮功能的生物環境。例如, 與體外表達蛋白相比, 直接在患者或動物模型的活檢組織中進行酶的功能實驗更有說服力。同樣，可以反映蛋白質全部生物學功能(如酶分解底物功能)的實驗則比僅反映一部分功能(如一種有附帶結合能力的蛋白水解ATP的功能)的實驗證據性更強。

功能實驗的有效性、重複性、穩定性應重點考慮，這些參數用來評估功能實驗的分析性能以及判定樣本診斷信息的完整性，該完整性容易受标本采集的方法及時間、存儲及運輸的影響。CLIA(臨床實驗室改進修正案)認證實驗室建立的檢測方法或商品化試劑盒可減少這些因素對實驗的影響。評估變異在剪接位點、編碼序列、非翻譯區以及更深的内含子區域的影響時，對變異在mRNA水平(如mRNA的穩定性、加工或翻譯)進行評估，可以提供豐富的信息. 相關的技術方法包括對RNA和/或互補DNA衍生物進行直接分析，以及體外剪接分析。

PS3證據的描述：

體内、體外功能實驗已明确會導緻基因功能受損的變異。注：功能實驗需要驗證是有效的，且具有重複性與穩定性。

BS3證據的描述：

在體内外實驗中确認對蛋白質功能和剪接沒有影響的變異。

功能學研究為理解變異對于蛋白質功能的影響提供了強有力的見解，并有助于對臨床意義未明的變異(VUS)進行重新分類，所以在不同變異的解讀中使用準确的、一緻性的功能實驗證據顯得非常重要。

然而，ACMG/AMP指南沒有提供關于如何評估功能實驗證據的詳細指導，而且PS3/BS3證據使用的差異是導緻不同臨床實驗室之間對于變異解讀不一緻的主要因素。

為了進一步規範變異解讀，臨床基因組資源()建立了變異解讀工作組( ,SVI)和不同的變異解讀專家組( ,VCEPs)，以對ACMG/AMP指南中每條證據标準進行優化。

到目前為止(當時發稿日)，6個不同疾病領域的VCEPs已經發布了相關建議，包括PS3/ BS3證據中可以使用哪些功能實驗及使用标準。不同VCEPs批準的實驗方法差異很大，包括剪接實驗，動物模型、細胞模型、不同的體外系統。VCEPs批準的實驗方法通常考慮了疾病的機制，大多數包括野生型對照，但是統計分析和納入對照的标準不太一緻。

不同的VCEPs在定義“已明确(well-)”的實驗方面存在顯著差異，如實驗設計、重複、對照、驗證等，這表明在評估功能學證據的質量和适用性上存在一些主觀性，可能會對變異的緻病性分類不一緻。

在整個PS3/BS3證據的改進過程中，使用了來自VCEPs開發的規則規範和專家意見。在缺乏嚴格統計學分析的情況下，評估适用于某一特定檢測方法的證據強度大小，以不同數量的之前分類過的變異作為對照，估算其理論的緻病性幾率(odds ，)。

将總體建模數據中的緻病變異比例作為先驗概率(P1)，将功能異常或功能正常組中的緻病變異比例作為後驗概率(P2)。

計算方法：

=[P2 ×(1−P1)]/[(1−P2)×P1]

然後根據計算所得的值選擇相應級别的證據強度(支持，中等，強，非常強very ).

需要考慮的要點和一般性建議

生理背景

在測定中評估的遺傳結構和背景是決定臨床變異解讀是否合适的重要考慮因素。在評估功能性實驗的有效性時，應考慮所用的實驗材料(如，患者來源的樣本、模式生物、體内細胞或體外系統)。

當使用患者來源的樣本時，功能分析時需要評估遺傳和生理環境(順式和反式的其他變異、表觀遺傳效應、細胞類型、實驗條件等)。

對于常染色體隐性遺傳病，緻病機制通常是功能缺失機制，外顯率和表現度可與總體蛋白質活性阈值有關，反映的是基因變異與潛在的基因産物組合産生的細胞/生化表型。在這種情況下，重要的是要将導緻不同表型(重度和輕度疾病)的總體蛋白活性水平與緻病或良性變異的功能實驗結果區分開。如果已知一種變異為純合子，并且可以在多個無關個體中檢出，則可以更有信心地解讀來自患者來源的功能實驗證據。

建議1：患者來源的樣本的功能實驗證據最能反映機體表型。一般而言，在有已知緻病變異或純合變異的患者中，最好先滿足PP4證據(特定表型)。

通常，模式生物用于揭示基因在疾病中的作用(如删除基因或人工突變，以重現表型作為遺傳病因的證據)。但是成本和效率相關問題限制了其應用。此外，模式生物在多大程度上能反映了人體解剖/生理/遺傳背景？或者為了滿足功能實驗證據标準，是否必須重現完整疾病表型？生物體的基因組可能含有同源基因(具有等效或相似的功能)，或者模式生物體可能缺乏人類表型的相關同源性，從而影響人為引入的遺傳變異引起的相關表型的表現程度。

即使在給定的物種内，可測量的表型也可能因生物體的遺傳背景而異(例如代償性變異)，因此最好使用多個品系或品種進行研究，但這會進一步增加實驗成本。因此，建議重點關注細胞和生化方面的體内或體外實驗，這是實驗室評估人類疾病相關的變異時常用的方法。

建議2：考慮到上述注意事項，從臨床變異解讀的角度來看，模式生物的功能證據評估應采用細緻的方法。如果将模式生物數據用于變異解讀，則應根據提供的總體數據的嚴謹性和可重複性調整證據強度。

分子結果

變異的性質和研究變異的環境可顯著影響實驗結果。在确定使用人工工程變異的檢測方法的臨床有效性時，必須仔細考慮變異對表達基因産物的影響。例如，在正常基因組背景下，技術引入的遺傳變異也是使用内源性細胞轉錄和剪接機制，必須考慮脫靶效應( )。相反，cDNA構建體的瞬時表達(通常包含人工啟動子和可能導緻變異過表達的其他調控序列)應使用對照，以确保過表達不會掩蓋變異的真實效應。無義變異和移碼變異導緻密碼子在倒數第2外顯子的3'端最多50個核苷酸之前提前終止，這些變異通過無義介導的降解機制(-,NMD)消除mRNA。因此，在NMD不活躍的cDNA或系統中研究這些變異可能不能反映内源性情況。同樣，核苷酸替換或其他框内變異對剪接的影響也不能使用cDNA構建體進行評估。另一方面，人工構建的cDNA表達可能可以在蛋白質水平上反映框内缺失變異或單核苷酸替換變異的功能。

建議3：雖然最好在更自然的基因組背景下驗證變異，但這不是确證實驗的要求。相反，應該考慮該實驗方法如何影響結果的解讀，并在确定證據強度時考慮研究是否控制了這些局限性。

由于單個功能實驗可能無法完全反映與疾病發病機制相關的所有基因或蛋白質功能，因此功能實驗的“正常”結果可能隻是反映在實驗中未恰當地檢測到特定變異的功能效應。因此，為了确定何時以及以何種強度應用BS3标準，必須了解功能實驗在多大程度上反映變異對蛋白的表達或蛋白功能域的影響。

還應該注意，不影響蛋白質功能的錯義或同義變異可能通過引入一個隐蔽的剪接位點而産生負面影響。在決定是否應用BS3以及應用何種強度時，應考慮到這些注意事項。

mRNA剪接是一個複雜的過程，臨床變異解讀可以同時考慮預測和實驗功能證據。利用内源性基因組背景或分析開發的RNA剪接驗證可用于确定變異對剪接完整性的影響。

例如，最後一個外顯子的異常剪接可能導緻功能仍然完整的截短蛋白。一般而言，異常剪接在mRNA和蛋白質閱讀框方面可能産生異質性結果。異常剪接的轉錄本可能發生NMD，而其他異常轉錄本可能導緻蛋白縮短或截短，并伴有或不伴功能後果。不同細胞類型中各種選擇性剪接轉錄本的相對轉錄豐度也可能影響下遊的病理生理過程。

由于RNA剪接驗證不能直接反映蛋白質功能，因此需要額外的建議來确定剪接實驗的适用性，以區分PS3/BS3與PVS1(功能缺失)。經典的±1,2剪接變異适用PVS1證據是基于預測的，變異對mRNA穩定性和蛋白閱讀框的影響，而功能驗證是證明存在異常剪接并确認功能喪失機制。

對于影響蛋白長度但預測不會導緻功能喪失的變異，例如由于異常剪接或大的框内缺失導緻框内外顯子跳躍，蛋白長度的變化可以單獨用PM4證據，而如果功能驗證實驗證實了變異對蛋白功能的影響，則也可以使用PS3/BS3。

術語

标準化結構化語言可以改善臨床實驗室、醫師和患者之間的溝通和透明度。應使用統一的術語來描述蛋白質功能的實驗室測定結果并記錄功能證據。因此，功能驗證的結果不應被歸類為“緻病性”或“良性”，因為這會影響其他證據的臨床判定。此外，将驗證結果描述為“有害的(/)”的術語可能會造成混淆，因為它們的含義在很大程度上與上下文相關，并且通常隻适用于功能喪失的疾病機制。

例如，疾病機制是功能獲得(gain-of-)的情況下，變異可能對生物體有害，但在功能實驗中對蛋白質活性沒有影響。建立标準化的語言來描述實驗結果是防止已發表數據的錯誤解讀和減少PS3/BS3應用方面實驗室間不一緻的重要步驟。

建議4：術語“功能正常”或“功能異常”應用于描述特定功能實驗中的特定變異功能影響。正如等人所概述的那樣，應該使用規範性術語來描述“功能異常”的影響(即功能完全喪失-of-、功能部分喪失 loss-of-，中間效應 ，亞效等位基因、功能獲得性gain-of-、顯性負性-)。對證據的最終評估應同時考慮實驗中的功能效應和疾病機制。

亞效等位基因( )：表型效應在程度上次于野生型的突變基因。該突變導緻基因功能部分喪失，通過(蛋白質、RNA)表達減少或功能表現降低而導緻的基因功能降低，但不是完全喪失。與純合子相比，在反式缺失等位基因中，亞效等位基因的表型更為嚴重。

CLIA實驗室開發的實驗

所有在臨床實驗室改進修正案( , CLIA)實驗室進行的檢測或使用市售試劑盒進行的檢測都必須經過内部使用的分析驗證。

建議5：執行功能驗證分析的實體不應管理是否滿足PS3/BS3标準或達到何種強度。這一确定應基于實驗的驗證，包括使用适當的實驗室對照和臨床驗證對照。

實驗對照和臨床驗證對照

良好的實驗室操作規範對于功能驗證證據在臨床變異解讀中的應用至關重要。每個實驗都應包括内部對照，實驗結果的動态範圍(例如，野生型和無效效應測定的結果)。在某些情況下，可以将實驗結果标準化為野生型值，通常應在與驗證變異相同的條件下運行。

實施良好的實驗通常使用技術重複，控制與方案或儀器相關的随機差異，以證明給定實驗中結果的可重複性。類似地，生物重複(例如，不同的菌落，細胞，或動物)需要控制随機的生物變異，并證明同一實驗的結果在不同實驗之間的可重複性。生物重複對于理解種群内的變異更為重要，而技術重複可以減少實驗誤差。

值得注意的是，在對這些驗證對照變異進行臨床解讀時，應使用獨立于功能數據的證據，以達到緻病性/可能緻病性或良性/可能良性的解讀。所需對照的數量取決于實驗的動态範圍和每次重複的差異；實驗對照還應與疾病機制(如獲得功能或喪失功能)和變異類型相關。

對于與不同機制的多種疾病相關的基因，如果疾病的機制不同，則對一種疾病進行驗證的檢測不一定适用于分析其他疾病的機制效應。

之前發表的許多實驗沒有已知的良性或已知的緻病性變異作為對照，或者可能在同一實驗中僅使用了少數變異作為對照。

在沒有功能驗證證據的情況下，任何被分類為可能良性/良性或可能緻病/緻病的變異均可作為确定證據強度的對照。

在同一類實驗的多個實例中進行測試時，可以将每種變異的檢測值繪制在一起，以便為正常、中間、異常設置阈值。

功能證據評估和應用的臨時框架

SVI工作組建議評估人員采用一個四步流程來确定功能實驗的适用性和證據強度：

(1)明确疾病機制；

(2)評估在該領域中使用的一般類型的功能實驗方法的适用性；

(3)評估具體案例中功能實驗的有效性；

(4)将證據應用于特定變異的解讀。

ACMG/AMP指南認為，有完整的功能實驗研究即可默認為“強”級别證據(PS3/BS3)。而SVI建議對功能驗證實驗的評估應從假設無證據開始，并随着臨床驗證證據的增加，使用不同強度水平的證據(支持、中等、強)。

1. 明确疾病機制

為了發揮功能實驗在遺傳變異解讀中的作用，必須充分理解潛在的基因-疾病機制，以确定哪些功能實驗是适用的。因為一些基因與不同的疾病相關，這取決于其不同的緻病機制(例如，功能獲得、功能喪失、顯性負效應)。

描述基因相關疾病的緻病機制的組成内容：

1）基因名稱：HUGO基因命名委員會(Gene , HGNC) 基因名稱

2）相關疾病

3）遺傳模式

(a)常染色體顯性遺傳

(b)常染色體隐性性遺傳

(c)線粒體遺傳

(d)X連鎖遺傳

(e)未确定

4）疾病緻病的分子機制

(a)功能喪失(loss of )

(b)功能獲得(gain of )

(c)顯性負效應( )

5）生物學通路

2.評估在該領域中使用的一般類型的功能實驗方法的适用性

評估功能實驗類型，如模型系統、實驗方法、功能實驗結果。應根據已定義的基因緻病機制進行評估(例如，功能喪失、功能獲得、特定通路輸出)。評估模型系統的相對優勢和弱點，動物、細胞和體外模型是否适用于特定疾病機制的研究。本步驟的目的是描述可以用于臨床變異解釋的适用的功能實驗類型。需要注意的是，證據的強度不是由功能實驗的類别決定的，而是由功能實驗驗證指标決定的。

對于正在制定特定基因指南的專家組，建議他們不要做出籠統的聲明，避免限制有效或适用的功能實驗類别，也不應限制基于功能實驗的證據強度。

3.評估具體案例中功能實驗的有效性

對于适用的一般類型的實驗方法，解讀人員下一步應該進行具體案例中功能實驗的有效性評估。許多不同的實驗室可能使用相同類型的功能實驗産生功能證據，但考慮到使用的具體方法和驗證水平的差異，在将數據用于臨床解讀之前，需要對每個功能實驗重複性進行評估。使用足夠數量的驗證對照來計算陽性預測值或确定值，可以提供最可靠的功能實驗證據。如果沒有這種水平的功能驗證，該功能實驗的預測價值是有限的。

3.1 功能證據不應用于以下情況(除非功能實驗的動态範圍和功能正常、不确定性或功能異常結果的定義阈值已經非常明确)：

3.2 使用支持水平的的緻病性()或良性()證據的場景:

對照和重複實驗，≤10個驗證對照；

實驗方法已被廣泛接受，以前已經被驗證過，或曾作為具有明确性能特征的試劑盒，但是對照和重複未記錄。

3.3 使用中等水平的的緻病性()或良性()證據的場景

3.4通過嚴格的統計分析計算出的，則使用相應強度的緻病性或良性證據。

不同的值，對應不同證據等級

4.将證據應用于特定變異的解讀

一旦對某一功能實驗方法的具體實例進行整體評估，則該功能實驗方法對某一特定變異的實驗結果可作為該變異解讀的證據。

累積證據