寫在前面:在細胞培養工作中,常需要了解細胞狀态和鑒别細胞死活,用于确定細胞接種濃度和數量以及了解細胞存活率和增殖度,來進行下一步的實驗操作,因此,就引入了我們今天要說的兩種細胞計數染料:台盼藍+AO/PI。
台盼藍染色法
台盼藍:藍灰色粉末;溶于水,微溶于乙醇,不溶于其他有機溶劑;細胞活性染料,是組織和細胞培養中最常用的死細胞鑒定染色方法之一,常用于檢測細胞膜的完整性,細胞是否存活。
台盼藍
台盼藍化學式
實驗原理:正常的活細胞,胞膜結構完整,能夠排斥台盼藍,使之不能夠進入胞内;而喪失活性或細胞膜不完整的細胞,胞膜的通透性增加,可被台盼藍染成藍色。通常認為細胞膜完整性喪失,即可認為細胞已經死亡。因此,借助台盼藍染色可以非常簡便、快速地區分活細胞和死細胞。
台盼藍染色的K562結果圖,藍色為死細胞
常用染色濃度:一般成品試劑是0.4%的儲存液,使用時需稀釋10倍
台盼藍染色的優點:價格低
台盼藍染色的缺點:①PBMC分離過程中會有紅細胞的殘留,其大小與PBMC 接近,台盼藍法不能分辨紅細胞與活的PBMC,易造成濃度與活率的差異;②CHO 細胞在培養過程中會産生細胞碎片和雜質,台盼藍法無法進行準确區分;
AO/PI染色法
AO/PI:是指吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)共同組成
吖啶橙(,簡稱AO):可以發出綠色熒光的DNA 結合染料
碘化丙啶(,簡稱PI):可以發出紅色熒光的DNA 結合染料組成
染色原理:AO 可以通過完整的細胞膜,嵌入所有細胞(活細胞和死細胞)的細胞核,呈現綠色熒光;PI 隻能通過不完整的細胞膜,即死細胞的細胞膜,嵌入所有死細胞的細胞核,呈現紅色熒光。當兩種染料均存在于細胞核内,在合适的AO、PI 配比下,兩種染料發生能量共振轉移,死細胞在綠色通道下(EX:525/30,EM:600LP)激發出紅色熒光。
AO/PI染色的K562結果圖,紅色為死細胞
染色濃度:一般都是買的成品試劑
AO/PI染色的優點:①彌補了台盼藍染色法的不足;②由于AO 和PI 為DNA結合染料,因此可有效排除雜質以及紅細胞的幹擾,确保對樣品進行準确計數;
AO/PI染色的缺點:成品試劑的成本較台盼藍高
有話要說...