AP最前沿 | 急性胰腺炎的起始事件：胰腺腺泡細胞内胞吞囊泡的胞内破裂、胞吐及與肌動蛋白的相互作用

據Journal of Physiology 2018年4月報道 題：Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis作者：Michael Chvanov等。

背景

胰腺腺泡細胞通過胞吐作用分泌消化酶和消化酶前體（酶原）。酶原被裝配在大的分泌細胞器内，在生理相關的促分泌劑縮膽囊素和乙酰膽堿誘導下由Ca2+信号級聯介導胞吐作用。酶原的Ca2+依賴性分泌涉及複合胞吐作用，其中分泌顆粒不僅與質膜發生融合，而且彼此發生融合形成大的後胞吐結構，繼而與質膜分離形成胞吞囊泡（EVs）。在生理狀态下，胰酶顆粒的胞吐作用僅發生在細胞頂端區域，病理情況下也可以發生在基底側。肌動蛋白絲可以和後胞吐結果相互作用，在調節胰腺腺泡細胞的胞吐作用鐘起到重要作用。在胞吐作用後，腺泡細胞分泌的酶原通過胰管系統轉運到十二指腸中，這種轉運依賴于胰腺腺泡和胰腺導管細胞的液體分泌。生理情況下，酶原的活化特異性地發生在腸道内。然而在急性胰腺炎中，一些酶原在胰腺内被激活從而啟動胰腺的自身消化，此過程的關鍵消化酶是胰蛋白酶。胰腺内胰蛋白酶原的激活時急性胰腺炎發展的早期事件，在臨床和實驗動物模型中都得到驗證。胰蛋白酶原胰腺内活化的機制仍有争議，有很大一部分證據認為和組織蛋白酶B有關。胰腺腺泡細胞中胰蛋白酶原的激活是體外腺泡細胞損傷死亡以及體内模型胰腺組織損傷的重要原因。雖然胞内胰蛋白酶原的激活得到解釋，但是啟動細胞器的本源仍有争議。酶原激活需要囊泡ATP酶（V-ATPase）和酸性内細胞器環境。囊泡的形成是急性胰腺炎誘導劑觸發腺泡細胞損傷的标志。我們最近研究了EVs内胰蛋白酶原的激活，這促使我們更進一步第研究這些細胞結構。

本研究最初的目的是描述在病理生理狀态下EVs形成的動力學。然而，在項目的早期我們偶然發現三個新的現象：EVs的破裂、胞吐和肌動蛋白的相互作用。因此，這個項目重新聚焦于這些新細胞事件的描述。

材料和方法

從成年CD1小鼠（6-8周）中獲得胰腺，制備細胞懸浮液與熒光探針共孵育。之後經CCK（10pM或10nM）誘導觀察EVs和胰蛋白酶的活性。

結果

1.EVs的标記、形成和大小

圖1

EVs快速形成可以被質膜不通透的熒光染料标記（熒光标記的葡聚糖）的胞内結構（圖1）。小分子LY和diS-Cy5标記的囊泡數與分子量為3和10kDa的熒光葡聚糖标記的相似。分子量為40和70kDa的葡聚糖被部分排除在EVs之外提示融合孔的直徑相對較小。在熒光标記的胰蛋白酶原中可以觀察到類似的部分排除（圖1A）。熒光探針LY，diS-Cy5和德克薩斯紅标記的葡聚糖（TRD）産生類似的EVs标記，在本研究中用于檢測和研究EVs的性質。

超大濃度的CCK（500pM和10nM）和毒性膽汁酸TLC-S（500μM）誘導劇烈的囊泡化（圖1B）。超大濃度的CCK或TLC-S誘導的EVs的數量和大小顯著大于CCK的生理濃度（10pM）誘導的或未被刺激的細胞（圖1B和C）。值得注意的是，大于2.5μm的EVs僅在超大濃度的CCK或TLC-S處理的細胞中觀察到（圖1C）。

2.EVs的破裂和肌動蛋白相互作用

圖1

D圖白色箭頭顯示10nM CCK刺激後的細胞EV膜的破裂和内容物釋放入胞漿。藍色箭頭提示胞質出泡，右側的圖顯示經曆破裂的EV和此過程中EV、細胞漿的熒光記錄，黑色箭頭表示如插圖所示的時間點和熒光強度。

由于病理性刺激形成的大的EVs可以揭示這些細胞器的破裂。用超大劑量的CCK刺激細胞時，一些EVs在細胞内破裂使得探針從EVs逸出到胞質溶膠中并增加胞漿的熒光（n = 30）（圖1D）。觀察一次破裂事件所需的時間約8 h（480 min）。為了觀察30個破裂，我們成像/分析了220個含有囊泡的細胞。EV的丢失可能是完全的（n = 17）（圖1D）或部分（n = 13）（未展示）。在大多數實驗中，質膜出泡和細胞死亡是發生在EV破裂之後（圖1D），表明EV破裂具有細胞毒性。細胞死亡發生在破裂後的27±4分鐘（n = 30）。我們選擇直徑大于2.5μm的液泡，在大的EV破裂期間可檢測到胞漿熒光增加提示該事件為破裂。因此，通過超大劑量CCK或TLC-S刺激形成的大尺寸EVs是特别重要的。

圖2

圖2A：左側為用10nM CCK刺激的腺泡細胞群，右側所示區域由白色虛線限定的區域。胰蛋白酶原激活（即由于BZiPAR裂縫導緻的熒光增加）以綠色顯示。EV中的胰蛋白酶原激活在囊泡形成後開始。 囊泡内BZiPAR介導的熒光增加通常是短暫的，其熒光的下降在囊泡破裂之前（即在TRD下降之前）開始。可能的原因是BZiPAR裂解R110的最終産物是具有膜滲透性的探針，因此很難保留在細胞内。在實驗結束時，我們觀察到細胞胞質中TRD熒光的增加表明質膜完整性（即細胞死亡）的喪失。圖2B：雙胰腺腺泡細胞經苯甲脒（1mM）處理30min用10nM CCK刺激。白色箭頭提示EV的破裂，右側顯示EV（紅）和胞漿（黑）的熒光跟蹤。白色虛線區域為感興趣的特定區域。蹤迹（1-3）與左圖的數字相對應，代表時間點和相應的熒光強度。

EVs是胰腺腺泡細胞中胰蛋白酶原激活的位點。通過TRD（檢測EVs）和BZiPAR（胰蛋白酶活性的熒光探針）的組合應用，我們觀察到胰蛋白酶原激活發生在EV破裂之前（n = 13）（圖2A）。值得注意的是，我們在胰蛋白酶抑制劑苯甲脒（n = 13）與CCK刺激的細胞共孵育中觀察到囊泡的形成和破裂（圖2B）。重要的是，使用的1mM苯甲脒能夠消除胰腺腺泡細胞内可溶性胰蛋白酶原的激活。實驗表明胰蛋白酶對EVs的破裂不是至關重要的。

圖3

圖3A：用10nM CCK刺激2小時後置于diS-Cy5和DTR，之後用标準細胞外液沖洗置于含FITCD的溶液中。FITCD圖提示細胞的質膜是完整的。3B：同（A）刺激後的細胞僅在diS-Cy5存在下記錄的代表性熒光發射光譜。通過595nm激光線激發熒光。該圖顯示記錄的EV（綠色）熒光光譜，細胞的胞漿滿足檢測EV破裂/滲漏的标準（紅色），胞漿不滿足檢測破裂/滲漏的标準（黑色）。插入的藍色軌迹是從滿足檢測破裂/滲漏的标準的細胞胞漿熒光減去黑色迹線（主要為細胞自發熒光）産生的。3C：左圖表示浸于含diS-Cy5指示劑的溶液中30分鐘但沒有刺激，隻有極少的小囊泡形成。該圖反映細胞胞漿熒光分布提示沒有破裂的EVs。藍線代表單個近似高斯的分布；右側為細胞與diS-Cy5共孵育2小時後，10nM CCK刺激的頻率直方圖，兩個近似高斯的峰如圖所示。細質熒光高于阈值的細胞被定義為經曆EVs的破裂/洩漏。3D顯示囊泡破裂的細胞比例。用苯甲脒（1mM）抑制絲氨酸蛋白酶， CA074（10μM）和CA074-Me（1μM）（縮寫為CA074 / Me）的組合對組織蛋白酶B的抑制不會産生顯著的細胞比例差異對比對照組胞質熒光的增加。用100nM巴弗洛黴素A1（Baf）抑制V-ATP酶也沒有在胞質熒光增加的細胞比例上存在統計學差異。

我們确實觀察到一定比例的細胞具有完整的質膜，但細胞質熒光略有增加，其光譜特性與研究EVs（diS-Cy5或TRD）實驗中使用的探針的光譜特性相對應（圖3A和B），并且這種細胞的比例在CCK刺激後增加（圖3C和D）。基于這些觀察，我們推斷細胞溶質熒光的增加是EV破裂或洩漏的結果。在實驗中，抑制胰蛋白酶（1mM苯甲脒）和組織蛋白酶B（CA-074 / Me）都沒有使diS-Cy5胞質熒光增加的細胞比例存在統計學差異（圖3D）。抑制V-ATP酶是抑制細胞内/細胞器内酶原激活的的另一種機制，包括EVs内胰蛋白酶原的激活。在CCK刺激前30分鐘用100nM BAF處理，不影響CCK刺激的細胞diS-Cy5細胞溶質熒光增加的比例（圖3D）。這些結果支持胰蛋白酶和組織蛋白酶B可能不參與EV破裂的觀點。

圖4

在未經過膠原酶處理的小胰腺組織部分塊中也觀察到具有完整質膜的CCK刺激細胞中出現細胞溶質diS-Cy5熒光（圖4）。因此現象不限于酶促分離的腺泡細胞或小的腺泡細胞簇。

圖5

圖5：第一列顯示胰腺腺泡細胞的透射光圖像，第二列顯示（表達LifeAct）活腺泡細胞的肌動蛋白分布，第三列為和内吞diS-Cy5熒光相關的圖像，第四列為合并圖像，第五列為放大的獨立囊泡。上排圖像顯示了EVs上完整F-肌動蛋白被膜。中間行顯示一個大的囊泡，具有不對稱的完整F-肌動蛋白被膜和很少或沒有相關的肌動蛋白被膜的較小囊泡。底部的圖像顯示具有不完全F-肌動蛋白被膜的EVs和很少或沒有相關F-肌動蛋白被膜的EVs。迹線顯示熒光強度分布的實例反映了肌動蛋白（LifeAct染色，黑色迹線）和内吞diS-Cy5（綠色迹線）的相對位置。沿着圖像上指示的箭頭測量熒光強度。

圖6

圖6A：第二列SirActin顯示肌動蛋白分布，第三列顯示肌動蛋白與固定在胰腺腺泡細胞中的内吞探針的相互關系。第四列為合并圖像。第五列放大的單個囊泡。上排圖像顯示披被F-肌動蛋白的EV。下排圖像為沒有相關的F-肌動蛋白被膜的EV。6B：肌動蛋白被膜明顯的不均勻性和開窗。圖像序列類似于（6A）描述的序列。。第五欄放大說明肌動蛋白被膜和合并圖像。黃色箭頭顯示肌動蛋白被膜的明顯開窗，而白色箭頭表示密度增加。6C：用1μM的Jasp處理腺泡細胞導緻CCK刺激的細胞中胞質的diS-Cy5顯著減少（P = 0.03）。

圖7

圖7：肌動蛋白的染色和EVs的破裂。用10nM CCK刺激細胞，内吞的diS-Cy5以綠色顯示。上部分圖片顯示兩個EV的破裂，LifeAct染色為白色。下部分的圖像顯示包含兩個大囊泡破裂的碎片（對應于上部分通道的前三個圖像）。黃色箭頭表示熒光探針通過肌動蛋白被膜中的開窗孔逃逸（上方囊泡）。最底層為合并圖像，肌動蛋白以洋紅色顯示。該圖顯示兩個囊泡在破裂之前的形狀變化，但是這些變化在未被肌動蛋白包被的下方囊泡中特别突出。

盡管有一些EV是容易破裂，但是其他的EV是穩定的并且可以保持熒光探針數小時。囊泡的這種異質性表明腺泡細胞内含有保護一部分囊泡的穩定因子并且這種因子的喪失可能是囊泡脆性和破裂的潛在機制。考慮到F-肌動蛋白在酶原顆粒複合胞吐作用中的突出作用，我們将其列為這一作用的關鍵。

我們在胰腺腺泡細胞中表達LifeAct（一種F-actin标志物），在EVs上觀察到肌動蛋白被膜。在10nM CCK刺激的細胞中，約28％的EV是有肌動蛋白被膜的（n = 89）（圖5）。在大約三分之一的囊泡中，肌動蛋白被膜是不完全或有孔的（圖5）。重要的是，很大比例的EV沒有肌動蛋白被膜（72％，n = 89）（圖4）。SiR-肌動蛋白（用于肌動蛋白的膜滲透性熒光探針）染色顯示肌動蛋白包被的EV（37％的EV，n = 119）（圖6A，上部）和未包被的EV（63％的EV，n = 119）（圖6A，下部）。盡管這兩種肌動蛋白染色方法都顯示出類似的現象，但沒有被膜的EV比例對于SiR-肌動蛋白來說略小。與LifeAct染色類似，SiR-肌動蛋白染色也顯示EV上肌動蛋白被膜的不均勻性和開窗（圖6B）。我們接下來利用肌動蛋白修飾化合物latrunculin-B和jasplakinolide研究肌動蛋白在EVs破裂（或阻止破裂）中的作用。Latrunculin-B（10μM）對CCK誘導diS-Cy5熒光升高的細胞比例增加沒有影響（對照組和latrunculin-B處理組均為12個細胞制劑）。

相對低濃度（1μM）jasplakinolide的使用沒有改變每個細胞的EV數（對照組中n = 112個細胞，jasplakinolide處理組中n = 103個細胞）。對照組（1.81±0.07μm，n = 223個液泡）和jasplakinolide處理組（1.89±0.07μm，n = 239個空泡組）之間的囊泡大小沒有統計學差異（P = 0.41）。然而，用1μM的jasplakinolide孵育導緻胞質diS-Cy5熒光增強的細胞比例中度但有統計學差異的（P = 0.03）降低（圖6C）。 Jasplakinolide是一種穩定肌動蛋白的藥物（Bubb等，1994），我們的研究結果表明，EV周圍的肌動蛋白可能在增強這些細胞器，防止其破裂或滲漏方面發揮作用。這種觀點得到圖7囊泡通過肌動蛋白塗層中的狹窄開窗破裂的支持。

3.EVs的胞吐作用

圖8

圖8A：經CCK刺激的腺泡細胞基底側質膜填充LY的EV發生融合（綠色，箭頭表示融合的EV）。細胞外培養基含有TRD（紅色），融合的特征在于探針的混入（黃色）。融合後，EV失去LY并獲得TRD。底部的圖像顯示包含融合EV的區域。該圖顯示EV中記錄的兩種染料熒光的時間過程（由虛線突出顯示）。8B顯示在CCK刺激的細胞的頂端區域LY填充的EV（綠色）與TRD填充的（紅色）後胞吐結構。底部的圖像顯示包含融合的EV（白色箭頭）的區域。融合後，複合結構含有兩種探針（黃色）。

在對EVs破裂的研究中，我們偶然發現了另一種允許胰蛋白酶逃離EV的限制的機制。這種機制涉及EVs的胞吐作用。為了系統地研究EV與質膜的融合能力，我們利用兩種細胞不可滲透的染料中的連續孵育細胞：LY和TRD。這些實驗的基本原理是通過EV和細胞外溶液之間的熒光分子的交換明确地識别融合事件。細胞在超大濃度CCK存在的情況下與LY孵育30分鐘形成LY填充的EVs。然後洗滌細胞并在TRD存在的情況下再次超大濃度CCK刺激，形成了許多充滿TRD的新EVs（圖8A）。在細胞基底區域發現的一些LY填充的EV能夠與細胞外溶液進行熒光探針交換（表現為LY的缺失和TRD的攝取），證實質膜基底部分的融合（n = 11）（圖8A）。與記錄EV的破裂的情況一樣，EV融合的直接成像是耗時的。需要大約an15.3小時（920分鐘）的共焦觀察時間來完成單個融合事件。除基底側融合事件外，一些LY填充的EV與細胞頂端部分充滿TRD的胞吐後結構融合，表明EVs在該區域可能發生二次胞吐作用（n = 7）（圖8B）。

結論

胰腺腺泡細胞利用複合胞吐作用分泌酶原。分泌（酶原）顆粒的異常複合胞吐作用導緻巨大EVs的形成。比較分泌顆粒和EVs的大小，我們推斷數十個甚至數百個分泌顆粒首先必須形成一個後胞吐Ω形結構，随後這種結構必須與質膜分離從而形成在TLC-S或超大劑量CCK刺激下的腺泡細胞中觀察到大的EVs（直徑高達12μm）。在EV中可能觀察到的胰蛋白酶原激活，是因為并非所有酶原都通過融合孔從後胞吐結構釋放。

EV包含潛在的破壞性消化酶（特别是胰蛋白酶）應該是無害的，直到它們逃逸到細胞溶膠或細胞外溶液中。我們利用分離的腺泡細胞和細胞簇發現大約40-50％的細胞至少有一個大的囊泡（圖1C）。考慮到囊泡破裂大約每8小時破裂一次，我們可以假設在誘導急性胰腺炎的動物模型所需的時間内（雨蛙素模型12-24小時），大約20-30％的細胞經曆EV的破裂。假設急性胰腺炎誘導的小鼠胰腺中細胞空泡化和空泡破裂的比例相似，可以推斷腺體中很大比例的腺泡細胞（可能是20-30％的細胞）可能被液泡破裂引發過程破壞。

研究結果提示囊泡内胰蛋白酶原激活和組織蛋白酶B活性不是EVs破裂的關鍵。我們觀察EVs長距離的移動和形狀的大幅度的改變。這些移動和形狀改變可能影響EVs囊泡與細胞骨架元素或細胞器在動态、擁擠的腺泡細胞内部的相互作用。我們認為這種相互作用産生的力量可能導緻EVs的破裂。在本研究中，我們發現并描述了EV的F-肌動蛋白被膜。這種與肌動蛋白間相互作用的行為可能有助于保護EVs免于破裂。因此，肌動蛋白被膜的丢失會導緻大的EVs的脆性和不穩定。

本研究描述急性胰腺炎誘導劑觸發途徑中的重要步驟。它遵循異常的Ca2+依賴性複合内吞作用和大EVs的形成。它還涉及EVs的破裂和它們與質膜的融合，包括介導胰蛋白酶釋放到細胞内和細胞外環境中的過程。

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翻譯：林佳佳

校對：葉 博