幹貨分享 | PCR知識分享
01
PCR 的基本原理
PCR是一種選擇性體外快速擴增DNA片段的方法。在體外以類似于細胞内DNA的半保留複制過程，以拟擴增的模闆DNA分子，與模闆DNA互補的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP及适合的緩沖體系組成的反應體系，經過重複地變性一退火一延伸三步，擴增新的目的DNA鍊，這個過程通過控制反應體系的溫度來實現。
PCR包含下列三步反應：
1、變性(denaturation)
将反應體系混合物經加熱至94℃左右，維持較短的時間，使雙鍊DNA變成單鍊DNA，便于下一步引物的結合。
2、退火(annealing)
将反應體系溫度下降到特定溫度（一般是引物的Tm值以下)，引物與DNA模闆以堿基互補的方式結合，形成模闆-引物雜交雙鍊。退火溫度是保證引物與DNA模闆互補結合的關鍵。由于引物結構簡單，加之引物量遠遠大于模闆DNA的數量，所以DNA模闆單鍊之間的互補結合很少。
3、延伸(elongation)
将反應體系的溫度上升到72℃左右并維持一段時間，在Taq DNA聚合酶的作用下，以引物為起始點，以4種單核苷酸（dNTP）為底物，從5'→3'方向延伸反應，合成新的DNA雙鍊。
以上三步反應為一個循環，重複進行變性、退火、延伸這三步反應，如此反複循環可以使DNA以指數形式進行擴增。上述過程1.5小時左右完成，從而使所需的目的DNA片段擴增放大百萬倍。
02
PCR反應液成分
PCR反應體系主要包含以下五種成分
1、模闆（template)
模闆即擴增用的DNA，可以是任何來源DNA(如基因組DNA、質粒DNA等)或RNA（如總RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA等），但必須符合兩個條件：一是純度必須較高，二是濃度不能太高以免抑制。
50μl PCR反應體系中模闆DNA推薦使用量如下表所示
2、引物（primers)
人工合成的一對引物可以分别與兩條模闆DNA互補結合的寡核苷酸序列，其中一條稱為上遊引物，另一條稱為下遊引物。引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR産物的特異性取決于引物與模闆DNA互補的程度。
(1)引物設計
引物設計的基本原則：①引物長度。15~30bp，常用為20bp左右；②引物堿基。G C含量以40%~60%為宜，G C太少擴增效果不佳，G C過多易出現非特異條帶。ATGC最好随機分布，避免5個以上的嘌嶺或密啶核苷酸的成串排列；③引物内部不應出現互補序列；④引物的Tm值。實際複性溫度選擇低于Tm值3-5 ℃。适當提高複性溫度可以提高引物與模闆結合的特異性，減少非特異産物的出現。⑤引物的序列。3'端必須與模闆正确配對，5’端可以不配對。引物的5'端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛标記，加入其他短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。⑥引物的濃度。一般使用終濃度各0.5umol/L，減量可以減少引物二聚體的産生。
(2)引物設計軟件
主要有Primer Premier5.0、Oligo6.0、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3
3 、底物(dNTP)
dNTP包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液将其pH調節至7.0~7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。一般存儲濃度為10mo/L，各成分以等當量配制，反應終濃度為20~200umol/L，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。
4、DNA聚合酶
PCR所用的酶主要有Taq和Pfu兩種來源，分别來自兩種不同的噬熱菌。其中，Taq擴增效率高但易發生錯配：Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以，實際使用時必須根據需要做不同的選擇。目前使用最多的是Taq酶。該酶在92.5℃、95.0℃和97.5℃時，其半衰期分别為130分鐘、40分鐘和5~6分鐘，可見該酶具有良好的熱穩定性。Taq酶還具有良好的延伸效率，其生物學活性在75~80℃時最高，一般用72℃，每一個酶蛋白分子每秒可延伸約150個核苷酸。
5、PCR緩沖液(PCR buffer)
緩沖液的成分最為複雜，除水外一般包括四種有效成分：①緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；②一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用铵根離子；③二價陽離子，即鎂離子，根據反應體系确定，除特殊情況外不需調整；④輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結構。
03
實用的PCR技術
1、巢式PCR：保證擴增特異性
巢式PCR是一種變異的聚合酶鍊反應(PCR)，使用兩對(而非一對)PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物(因為他們在第一次PCR擴增片段的内部)結合在第一次PCR産物内部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增産生了錯誤片段，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。
實驗步驟：
第一步：目标的DNA模闆藍色的第一對引物結合。第一對引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上并擴增多種産物。但隻有一種産物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種産物）。
第二步：使用圖中紅色标記的第二套引物對第一輪PCR擴增的産物進行第二輪PCR擴增。由于第二套引物位于第一輪PCR産物内部，而非目的片斷包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增确保第二輪PCR産物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。
2、TouchdownPCR ：提高擴增特異性
降落PCR（touch down PCR）：指的是每一個（或n個）循環退火溫度逐步降低1度，直到達到一個較低的退火溫度，該溫度稱為：“touchdown'退火溫度，然後在該溫度下繼續循環10個左右循環。退火溫度的起始溫度高于計算的Tm15度左右，在接下來的循環中，退火溫度每個循環降低1－2度（一般為1度），直到低于Tm值5度。
該策略的目的在于确保第一個引物－模闆雜交事件發生在最互補的反應物之間，即特異行擴增的反應物之間，當退火溫度降低到非特異性擴增發生的水平時，特異産物在此時已經有一個幾何數的起始優勢，在剩餘的反應中，特異産物會競争非特異産物，特異産物始終優先擴增，從而産生單一的占主導地位的擴增産物。該方法主要用于避免非特異性PCR産物的出現，尤其是當使用複雜的基因組DNA模闆，非特異性退火易發生時。
3、OverlapPCR：多片段體外連接
重疊PCR由于采用具有互補末端的引物,使PCR産物形成了重疊鍊，從而在随後的擴增反應中通過重疊鍊的延伸，将不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要内切酶消化和連接酶處理，可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性内切酶消化的方法難以得到的産物。重疊延伸PCR技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計。重疊延伸PCR在基因的定點突變、融合基因的構建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的應用。
引物設計：
第一個片段的下遊引物反向互補，置于作為第二個片段上遊引物的5'端’；第二個片段的上遊引物反向互補，置于作為第一個片段下遊引物的5'端’；以此類推。
編輯｜魏 萬
審核｜宋 問
5/1
2022
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